Mecanismos de resistência do Glioblastoma ao antitumoral Temozolomida em células cultivadas como modelos tridimensionais (3D) in vitro e in vivo: O papel das polimerases de Síntese de Translesão

• Processo: 23/10452-8
• Modalidade de apoio: Bolsas no Exterior - Estágio de Pesquisa - Pós-Doutorado
• Data de Início da vigência: 01 de março de 2024
• Data de Término da vigência: 15 de fevereiro de 2025
• Área de conhecimento: Ciências Biológicas - Genética - Mutagênese
• Pesquisador responsável: Carlos Frederico Martins Menck
• Beneficiário: Diego Luis Ribeiro
• Supervisor: Chunzhang Yang
• Instituição Sede: Instituto de Ciências Biomédicas (ICB). Universidade de São Paulo (USP). São Paulo , SP, Brasil
• Instituição Anfitriã: Center For Cancer Research, Estados Unidos
• Vinculado à bolsa: 20/02836-2 - Mecanismos de resistência de Glioblastoma ao antitumoral temozolomida em células cultivadas como esferoides multicelulares tumorais em três dimensões (3D) in vitro: o papel das polimerases de síntese translesão, BP.PD
• Assunto(s): Glioblastoma Reparo do DNA
• Palavra(s)-Chave do Pesquisador: glioblastoma | Mutational Signatures | Temozolomide | translesion synthesis | Xenograft Tumors | 3D tumoroids | Reparo de DNA

Resumo

A Temozolomida (TMZ) é o medicamento antitumoral mais utilizado no Glioblastoma Multiforme (GBM). No entanto, células resistentes à quimioterapia são recorrentes devido a muitos fatores, sendo um deles o mecanismo de Síntese de Translesão (TLS), que permite que as células tumorais tolerem danos genômicos ao contornar lesões no DNA. Especificamente, as polimerases de DNA Kappa (Polº) e Iota (Pol¹) da TLS estão associadas à resistência à quimioterapia, mas pouco se sabe sobre a resistência do GBM. Para entender esse mecanismo, este trabalho já analisou os efeitos citotóxicos, antiproliferativos, antimetastáticos e genotóxicos do TMZ em células de GBM U251MG WTE (selvagem) e CRISPR/Cas9 KO para as células TLS Polº e Pol¹ cultivadas como esferoides tumorais 3D in vitro. Os resultados mostraram que o TMZ (10-200 µM) promove efeitos antiproliferativos, especialmente em esferoides 3D TLS Polº e Pol¹ KO. Além disso, observamos citotoxicidade significativa, morte celular (Caspase 3/7), genotoxicidade (53BP1) e efeitos antimetastáticos (migração/invasão) em esferoides TLS Polº/Pol¹ KO quando comparados ao WTE após tratamentos com TMZ (25-200 ¼M). Todos os resultados anteriores indicam que TLS Polº e Pol¹ estão envolvidos na quimiorresistência ao TMZ em células de GBM, embora seja necessário compreender melhor os mecanismos de ação. Inicialmente, pretendíamos identificar os perfis de assinaturas mutacionais por Sequenciamento de Exoma Completo (WES) de células GBM TLS pols KO e WTE após tratamentos com TMZ. Além disso, tais modelos 3D podem demonstrar respostas fisiopatológicas semelhantes in vivo, estabelecendo tumores xenotransplantados a partir de células GBM (WTE e TLS Pols KO) e analisando o perfil mutacional após tratamentos com TMZ pode esclarecer as respostas biológicas entre ambos os modelos. Finalmente, como as células-tronco de glioma (GSC) são descritas como responsáveis pela resistência ao TMZ e as pols TLS podem ser superexpressas nesse tipo de célula, pretendemos desenvolver/estabelecer pela primeira vez o modelo de "tumoróides" de tumor 3D a partir de células GBM (U251MG) que expressam GSC in vitro para ajudar a entender a resistência ao TMZ. Essa abordagem inovadora de cultura de células 3D representa um avanço significativo em relação aos métodos anteriormente utilizados no laboratório, ampliando o escopo da pesquisa do GBM. Usando tumoróides 3D a partir de células U251MG (WTE e TLS Pol¹/Polº KO) ricas em GSC, pretendemos avaliar os efeitos do TMZ no diâmetro/morfologia e, por meio de imunofluorescência, analisar marcadores de células-tronco (SOX2 e OCT4), genotoxicidade (H2Ax) e ciclo celular (usando o plasmídeo do repórter Fast-FUCCI). O Estágio BEPE está sendo submetido para executar todos os objetivos mencionados em colaboração com o grupo de pesquisa do Dr. Chunzhang Yang no Ramo de Neuro-Oncologia do Instituto Nacional de Saúde (NIH) dos EUA, por 12 meses (janeiro/2024 - dezembro/2024). O NCI/NIH possui instalações equipadas com tecnologia de ponta e infraestrutura de última geração para realizar análises genômicas, bioinformáticas e in vivo, com eficiência de tempo e custos significativamente mais baixos do que no Brasil. O Dr. Chunzhang tem excelente experiência em estudos de gliomas e mecanismos de resistência à quimioterapia com TMZ, utilizando técnicas de biologia molecular e modelos pré-clínicos para entender as vias moleculares (incluindo reparo de DNA) em tumores cerebrais. Esperamos que os resultados nos ajudem a entender melhor o papel das pols TLS na resistência ao TMZ, indicando um potencial alvo para o tratamento de pacientes com GBM.