Caracterização bioquímica de F-box like proteins (FLPs) em Leishmania infantum.

• Processo: 23/12058-5
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Mestrado
• Data de Início da vigência: 01 de abril de 2024
• Data de Término da vigência: 31 de março de 2026
• Área de conhecimento: Ciências Biológicas - Bioquímica - Biologia Molecular
• Pesquisador responsável: Felipe Roberti Teixeira
• Beneficiário: Wesley Klaysson Pereira Regatieri
• Instituição Sede: Centro de Ciências Biológicas e da Saúde (CCBS). Universidade Federal de São Carlos (UFSCAR). São Carlos , SP, Brasil
• Assunto(s): Leishmania infantum Ubiquitinas
• Palavra(s)-Chave do Pesquisador: f-box like protein | leishmania infantum | Ubiquitina | Bioquímica

Resumo

A proteólise intracelular em eucariotos é mediada principalmente pelo Sistema Ubiquitina Proteassoma (SUP), o qual atua por meio da ação em cascata de três enzimas: E1 (enzima ativadora de ubiquitina), E2 (enzima carreadora de ubiquitina) e as E3 (ubiquitina-ligases), que são essenciais neste processo, uma vez que reconhecem e transferem a ubiquitina para os substratos alvos. A proteólise intracelular é crucial em protozoários parasitas, visto que são importantes na alternância de hospedeiros em seus ciclos de vida, e, portanto, para o sucesso do parasitismo. Apesar disso, o SUP é pouco estudado na maioria dos parasitos, incluindo os tripanossomatídeos do gênero Leishmania, responsáveis por causarem as leishmanioses, importante grupo de doenças negligenciadas. A espécie Leishmania infantum é o agente etiológico da Leishmaniose Visceral (LV) no Brasil, que provoca a forma mais grave da doença, podendo ser fatal caso não ocorra o tratamento adequado. As subunidades do proteassoma de Leishmania apresentam alto grau de identidade ao de humanos, e, por isto, são alvos de drogas para tratamento de leishmanioses. A caracterização das enzimas E2 e deubiquitinases de L. mexicana em estudos recentes demonstraram que elas são essenciais na proliferação, infecção e sucesso do seu parasitismo. No entanto, as E3 ubiquitina-ligases de Leishmania ainda são pobremente estudadas. Neste projeto, propomos caracterizar bioquimicamente os genes LINF_140018100 (F-box like protein 3 - FLP3), LINF_330019800 (F-box like protein 4 - FLP4), LINF_340019100 (F-box like protein 5 - FLP5) e LINF_360032300 F-box like protein 6 - FLP6) de L. infantum, os quais foram identificados por espectrometria de massas como proteínas parceiras da SKP1, em resultados obtidos pelo nosso grupo (A.R. FAPESP 2020/15771-6) reunidos num artigo em preparação. Para isso, parasitos de L. infantum serão geneticamente modificados por meio da estratégia CRISPR-Cas9 para inserção de tags 3xmyc-mCherry nestes genes e para construção de linhagens nocautes. Realizaremos a caracterização bioquímica destas linhagens através da identificação dos ligantes das proteínas codificadas por estes genes através de imunoprecipitação das proteínas em fusão com myc-tag, seguido de análise por espectrometria de massas. Buscaremos no interactoma possíveis substratos de FLP3, FLP4, FLP5 e FLP6 de L. infantum, afim de elucidar as suas funções em L. infantum. As linhagens nocautes viáveis serão caracterizadas quanto a taxa de crescimento e infecção in vitro. Assim, os resultados deste projeto contribuirão para o conhecimento da fisiologia deste parasito podendo levar a identificação de novos alvos para intervenção farmacológica visando o tratamento das leishmanioses.