Análise do perfil de glicosilação da proteína R-Espondina 1 humana recombinante (rhRSPO1) produzida por células CHO-DG44 glico-engenheiradas

• Processo: 24/00036-0
• Modalidade de apoio: Bolsas no Exterior - Estágio de Pesquisa - Doutorado Direto
• Data de Início da vigência: 05 de agosto de 2024
• Data de Término da vigência: 04 de fevereiro de 2025
• Área de conhecimento: Ciências Biológicas - Bioquímica - Biologia Molecular
• Pesquisador responsável: Mari Cleide Sogayar
• Beneficiário: Vitor Prado Colantoni
• Supervisor: Weston Struwe
• Instituição Sede: Instituto de Química (IQ). Universidade de São Paulo (USP). São Paulo , SP, Brasil
• Instituição Anfitriã: University of Oxford, Inglaterra
• Vinculado à bolsa: 22/01906-2 - Glico-engenharia de células CHO-DG44 para produção de R-Espondina 1 humana recombinante (rhRSPO1) com alto teor de cadeias de glicanos N-ligados terminalmente sialilados, BP.DD
• Assunto(s): Engenharia genética Espectrometria de massas
• Palavra(s)-Chave do Pesquisador: Biologia molecular | engenharia genética | espectrometria de massa | Expressão recombinante de biofármacos | Glicoengenharia de proteínas | Perfil de Glicosilação | Engenharia genética, Glicoengenharia de proteínas, Expressão recombinante de biofármacos, Perfil de Glicosilação de proteínas

Resumo

Linhagens celulares derivadas de células de ovário de hamster chinês (CHO), particularmente a linhagem celular CHO-DG44, são as mais utilizadas para produção de proteínas bioterapêuticas em todo o mundo devido às suas diversas características vantajosas, como sua alta similaridade com células humanas em termos de modificações pós-traducionais de proteínas, apesar de apresentarem baixa capacidade de sialilação terminal de glicanos ligados a glicoproteínas durante o processo de glicosilação. Esta característica representa uma desvantagem importante deste sistema de expressão devido aos efeitos positivos da sialilação terminal na meia-vida plasmática, na imunogenicidade e, consequentemente, na atividade biológica das proteínas. Considerando sua ampla utilização para a produção de biofármacos sob condições de cGMP e suas diversas vantagens para expressão heteróloga de proteínas recombinantes, torna-se evidente a necessidade de estabelecer uma plataforma de expressão baseada em células CHO-DG44 que apresente alta capacidade de sialilação terminal de glicoproteínas. A fim de abordar esta questão, este projeto visa estabelecer uma linhagem celular CHO-DG44 capaz de produzir glicoproteínas com alto teor de glicanos N-ligados terminalmente sialialdos através da expressão ectópica de duas enzimas críticas da via de sialilação: ²-galactosídeo ±-2,6-sialiltransferase 1 (ST6GAL1), que catalisa a adição de moléculas de ácido siálico à galactose presente nas extremidades de cadeias de oligossacarídeos N-ligadas, e a UDP-N-acetilglucosamina 2-epimerase / N- acetilmanosamina quinase (GNE), que catalisa as duas primeiras reações da via de síntese do ácido siálico. Para avaliar os efeitos da superexpressão recombinante de ST6GAL1 e GNE no perfil de glicosilação de células CHO-DG44, decidimos promover a expressão ectópica da proteína R-Spondina 1 humana recombinante (rhRSPO1), uma glicoproteína secretada conhecida por seu importante papel na regulação da proliferação, diferenciação e morte celular por indução da via Wnt/²-catenina. Para analisar o perfil de glicosilação da rhRSPO1 produzida pelas células CHO-DG44 parentais e glicoengenheiradas, as amostras de rhRSPO1 purificadas serão caracterizadas usando uma abordagem glicoproteômica por espectrometria de massas nativa.