Seleção in silico e avaliação analítica de oligonucleotídeos para o diagnóstico molecular específico para Leishmania (Leishmania) infantum por PCR em tempo real com sonda de hidrólise

• Processo: 24/05680-4
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Iniciação Científica
• Data de Início da vigência: 01 de junho de 2024
• Data de Término da vigência: 31 de maio de 2025
• Área de conhecimento: Ciências Agrárias - Medicina Veterinária - Medicina Veterinária Preventiva
• Pesquisador responsável: Rodrigo Martins Soares
• Beneficiário: Isabella Opsfelder de Almeida
• Instituição Sede: Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia (FMVZ). Universidade de São Paulo (USP). São Paulo , SP, Brasil
• Assunto(s): Cães Técnicas de diagnóstico molecular Leishmania infantum Reação em cadeia da polimerase em tempo real Doenças parasitárias
• Palavra(s)-Chave do Pesquisador: Cães | Diagnóstico Molecular | leishmania infantum | pcr em tempo real | sonda de hidrólise | Doenças Parasitárias

Resumo

Um problema relevante para o controle da Leishmaniose Visceral (LV) é a ausência de testes laboratoriais com boa acurácia para diagnosticar a infecção, particularmente em cães. Os cães são os principais reservatórios e fontes de infecção do parasito em áreas urbanas no Brasil, por isso, o controle da LV em áreas urbanas é baseado em ações adotadas sobre estes hospedeiros. Para identificar cães infectados por Leishmania infantum, o agente causal da LV no país, os métodos sorológicos são os mais empregados, devido ao seu baixo custo e facilidade de execução. Porém, estes testes têm sensibilidade diagnóstica insuficiente e não necessariamente permitem detectar animais que estejam transmitindo o agente. Assim, provas baseadas na detecção direta do agente têm sido amplamente indicadas e, entre estas provas, destacam-se as provas moleculares como a PCR e suas variações. A PCR em tempo real (qPCR) tornou-se muito popular, pois trata-se de um método rápido e menos suscetível à contaminação cruzada do que a PCR convencional porque dispensa a necessidade de abrir tubos de reação para análises pós-PCR. A qPCR depende da captação e análise de sinais fluorescentes produzidos durante a amplificação. A fluorescência pode ser gerada usando corantes fluorescentes intercalantes ou sondas fluorescentes. O uso de sondas fluorescentes é mais oneroso do que corantes intercalantes, mas permite ensaios em multiplex e, por depender da hibridização bem-sucedida de uma sonda, tende a produzir resultados com maior especificidade. Portanto, esta abordagem está menos sujeita a gerar falsos positivos do que o método baseado no uso de corante intercalante. Um ponto importante em relação aos inquéritos diagnósticos para detecção de infecções por L. infantum diz respeito a reações cruzadas com infecções por outras espécies do gênero, já que na maioria das áreas endêmicas para LV no Brasil as espécies de Leishmania associadas a leishmaniose tegumentar também podem ocorrer. Por isso, é desejável que métodos para o diagnóstico de leishmanioses sejam capazes de identificar corretamente a espécie do parasito envolvido na infecção, seja para tomada de decisão correta em terapias, seja para conhecimentos epidemiológicos necessários para a implementação de medidas de controle. Embora exista farta documentação científica sobre provas moleculares para o diagnóstico diferencial entre espécies do gênero Leishmania, a grande maioria delas refere-se a métodos baseados em PCR convencional associado à restrição enzimática ou sequenciamento de ácidos nucleicos. São poucos os trabalhos desenvolvidos com qPCR com capacidade de diferenciação de L. infantum das demais espécies, sendo a maioria baseada em sistemas de detecção por corantes intercalantes e muito poucos com sistemas de sondas fluorescentes. Por isso, o projeto que se apresenta é dedicado a identificar marcadores moleculares para qPCR com o uso de sonda fluorescente que tenha capacidade de distinguir L. infantum das demais espécies do gênero por meio de pesquisas em literatura científica e uso de softwares de análises (avaliação in silico). Conjuntos candidatos de primers e sondas identificados nas análises in silico terão seu desempenho analítico e diagnóstico avaliados em amostras de cultura de Leishmania spp. e em amostras de cães naturalmente infectados, respectivamente.