Caracterização estrutural e inibição de bombas de efluxo do grupo ESKAPE utilizando sybodies

• Processo: 24/02417-0
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Doutorado Direto
• Data de Início da vigência: 01 de agosto de 2024
• Data de Término da vigência: 29 de fevereiro de 2028
• Área de conhecimento: Ciências Biológicas - Bioquímica - Química de Macromoléculas
• Pesquisador responsável: Andrea Balan Fernandes
• Beneficiário: Vinícius Carneiro Barbosa
• Instituição Sede: Instituto de Ciências Biomédicas (ICB). Universidade de São Paulo (USP). São Paulo , SP, Brasil
• Assunto(s): Inibição Nanocorpos Resistência a medicamentos Elementos estruturais de proteínas
• Palavra(s)-Chave do Pesquisador: Eskape | Inibição | Nanobodies | Resistência a drogas | Sybodies | Transportador ABC | Estrutura de Proteínas

Resumo

Proteínas de membrana contabilizam entre 25% e 30% de todas as sequências transcritas nos genomas de organismos, exercendo uma grande variedade de funções vitais para o metabolismo celular, um dos motivos que as tornam relevantes para a indústria farmacêutica, contabilizando um total de 50% de todos os alvos para a produção de fármacos. Anticorpos, nanobodies e sybodies (anticorpos sintéticos) tem sido uma abordagem interessante para a compreensão da função, modulação, inibição e aumento de estabilidade para estudos estruturais destas proteínas, mas sua produção ainda necessita das proteínas purificadas. Estudos mostram que regiões hidrofílicas expostas para o exterior da membrana plasmática são os principais alvos dos anticorpos e derivados. Nesta proposta, trazemos uma abordagem diferente para a produção de sybodies contra uma classe de proteínas de membrana encontradas em todos os organismos, de grande relevância no fenômeno de resistência múltipla a drogas, e que são estruturalmente conservadas. As proteínas são transportadores ABC (ATP-Binding Cassette) do tipo exportadores (classe IV) que constituem bombas de reciclagem de lipídios na membrana e bombas de efluxo de drogas e antibióticos em bactérias multirresistentes do grupo ESKAPE (Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa e Enterobacter spp.). Utilizaremos o transportador Sav1866 de Staphylococcus aureus, extensivamente caracterizado do ponto de vista funcional e estrutural, como âncora para a apresentação das regiões hidrofílicas de ortólogos presentes em bactérias multirresistentes a drogas. Ainda, pretende-se caracterizar o potencial de inibição dos sybodies em relação ao transporte de drogas efetuado por estas proteínas e como o potencial estabilizador das proteínas para estudos estruturais. Para a produção dos transportadores, utilizaremos protocolos estabelecidos na literatura e em nosso laboratório e para a construção dos sybodies, serão utilizadas as metodologias de phage display, ribosome display e ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay). As estruturas dos transportadores que ainda não possuam caracterização serão resolvidas por crio-microscopia eletrônica. O grupo conta com a colaboração do Prof. Markus Seeger da Universidade de Zurique que desenvolveu a metodologia e uma plataforma de produção de sybodies e da Dra. Daniela Luz do Instituto Butantan para a realização dos ensaios de phage-display e ribosome display em condições BPL. Adicionalmente, ensaios de interação dos transportadores com os sybodies utilizando ressonância plasmônica de superfície e testes biofísicos, serão realizados em colaboração com o Prof. Marko Hyvonen da Universidade de Cambridge e estudos estruturais dos transportadores em colaboração com o Prof. Albert Guskov da Universidade de Groningen, especialista na caracterização estrutural de transportadores ABC por crio-microscopia eletrônica. A proposta tem ainda um alto potencial de inovação e pode derivar outros projetos para estudos de modulação e inibição de bactérias multirresistentes.