Usando simulações por dinâmica molecular e crio-microscopia eletrônica para entender resistencia antimicrobiana em Mycobacterium tuberculosis

• Processo: 24/06177-4
• Modalidade de apoio: Bolsas no Exterior - Estágio de Pesquisa - Doutorado Direto
• Data de Início da vigência: 04 de novembro de 2024
• Data de Término da vigência: 03 de novembro de 2025
• Área de conhecimento: Ciências Biológicas - Biofísica - Biofísica Molecular
• Pesquisador responsável: Marcio Vinicius Bertacine Dias
• Beneficiário: Nicolas de Oliveira Rossini
• Supervisor: Paulo Cesar Telles de Souza
• Instituição Sede: Instituto de Ciências Biomédicas (ICB). Universidade de São Paulo (USP). São Paulo , SP, Brasil
• Instituição Anfitriã: École Normale Supérieure, Lyon (ENS), França
• Vinculado à bolsa: 21/14205-0 - Determinação das bases estruturais dos mecanismos de resistência baseado em mutações missenses em Mycobacterium tuberculosis à antimicrobianos de primeira e segunda linha, BP.DD
• Assunto(s): Biologia estrutural Simulação de dinâmica molecular Enzimas Tuberculose
• Palavra(s)-Chave do Pesquisador: Biologia Estrutural | Cryo-EM | Dinâmica Molecular | enzimas | Mecanismos de resistência | Tuberculose | biofísica e bioquímica de proteínas

Resumo

Dentre os principais medicamentos utilizados no tratamento da tuberculose, isoniazida (INH) é considerada um fármaco de primeira linha e as fluoroquinolonas (FQL), principalmente a Moxifloxacina (MFX), estão ganhando espaço nos regimes de tratamento mais atuais. Particularmente, para a INH e MFX, os seus alvos, que incluem as enzimas InhA, e a DNA girase, respectivamente, apresentam a característica de terem mutações missenses. Entretanto, pouco é conhecido sobre o impacto dessas mutações sobre o mecanismo molecular da resistência de M. tuberculosis à INH e MFX. Durante o projeto regular de Doutorado direto, foram selecionadas uma série de mutações missenses observadas nos genes inhA, que codifica para uma ACP-enoil redutase (InhA) e em gyrA e gyrB, que para DNA girase, alvo do MFX. Essa seleção foi feita a partir de isolados clínicos de diversos países, que ainda não foram biofísica e bioquimicamente caracterizadas de forma satisfatória. Até o presente momento, fomos capazes de construir dezesseis novas construções para enzimas mutantes de InhA e DNA girase (GyrBA). Em relação à InhA, fomos capazes de obter doze novas estruturas na presença da coenzima NADH e do aducto inibitório INH-NAD, realizar estudos calorimétricos preliminares através de ITC e também averiguar o desenovelamento térmico dessas proteínas por DSF, acrescentando importantes informações acerca de novos mecanismos de resistência associados com essa enzima. Também fomos capazes de padronizar a expressão de GyrBA, e realizamos tentativas de obtenção da estrutura dessa enzima por Crio-microscopia eletrônica na forma APO. Desta forma, propomos para neste projeto a realização de simulações por dinâmica molecular das estruturas de InhA obtidas, usando modelos atomísticos. Para o estudo de mutações que possam afetar o estado de oligomerização da enzima, pretendemos empregar modelos coarse-grained para avaliar a estrutura tetramérica das enzimas. Em relação à proteína GyrBA e seus mutantes, pretendemos obter as estruturas dessas enzimas em complexo com o DNA e a moxifloxacina através da técnica de crio-microscopia eletrônica e tambémr realizar simulações de dinâmica molecular. A aplicação desses métodos permitirá um melhor entendimento do efeito de mutações sobre a estrutura desses alvos.