Explorando mudanças conformacionais induzidas por GTP em septinas usando crio-EM de alta resolução

• Processo: 24/18756-9
• Modalidade de apoio: Bolsas no Exterior - Estágio de Pesquisa - Pós-Doutorado
• Data de Início da vigência: 01 de março de 2025
• Data de Término da vigência: 28 de fevereiro de 2026
• Área de conhecimento: Ciências Biológicas - Biofísica - Biofísica Molecular
• Pesquisador responsável: Richard Charles Garratt
• Beneficiário: Diego Antonio Leonardo Cabrejos
• Supervisor: Bruno Klaholz
• Instituição Sede: Instituto de Física de São Carlos (IFSC). Universidade de São Paulo (USP). São Carlos , SP, Brasil
• Instituição Anfitriã: Institut De Génétique Et De Biologie Moléculaire Et Cellulaire, França
• Vinculado à bolsa: 21/08158-9 - Estudos cristalográficos de septinas, seus domínios e seus complexos, BP.PD
• Assunto(s): GTP fosfo-hidrolases
• Palavra(s)-Chave do Pesquisador: Cryo-EM | GTPases | protein-protein interaction | Septins | Structural Biology | Criomicroscopia eletrônica

Resumo

Septinas são componentes cruciais do citoesqueleto, envolvidas em uma ampla gama de processos celulares, incluindo citocinese, compartimentalização de membranas e tráfico de vesículas. Para desempenharem suas funções, as septinas precisam formar heterofilamentos, que subsequentemente se organizam em estruturas de ordem superior, como anéis, redes e mais. Classificadas em quatro grupos, os heterofilamentos de septinas podem ser compostos por um representante de cada grupo, dispostos em uma ordem específica e estabilizados por interfaces de contato conhecidas como interface G (domínio de ligação a nucleotídeos (GTP/GDP) e interface NC (domínios N- e C-terminais). Em mamíferos, o heterofilamento pode ser montado a partir de octâmeros formados por SEPT2-6-7-9-9-7-6-2, sendo a interface NC formada por SEPT9-9 crítica para a montagem de octâmeros a partir de tetrâmeros. Além disso, essa interface apresentou mudanças conformacionais dependendo do nucleotídeo ligado (GTP ou GDP), sugerindo um mecanismo de comunicação entre a interface G e a interface NC associado à hidrólise de GTP. Apesar de sua importância biológica, esse mecanismo e sua relação com a montagem de filamentos, particularmente o papel da hidrólise de GTP, permanecem pouco compreendidos. Este projeto tem como objetivo investigar esses mecanismos resolvendo estruturas de alta resolução de complexos de septinas usando Microscopia Crioeletrônica de Partículas Isoladas (Crio-EM). Focando no tetrâmero central SEPT7-9-9-7, esta pesquisa busca capturar mudanças conformacionais nas septinas durante a ligação e a hidrólise de GTP, elucidando a comunicação entre as interfaces G e NC recentemente proposta pelo nosso grupo de pesquisa (Mendonça et al. 2024). O complexo recombinante SEPT7-9-9-7 será coexpressado e purificado, após o qual será incubado com um excesso de análogos de GTP não hidrolisáveis (GppNHp ou GTP¿S) para induzir a troca de GDP por GTP e, assim, obter estruturas em ambos os estados. Essas estruturas fornecerão insights inéditos sobre as mudanças conformacionais dinâmicas críticas para a montagem dos filamentos de septinas. A realização desta pesquisa no laboratório do Dr. Bruno Klaholz, um laboratório líder em crio-EM com instrumentação avançada na instalação associada, proporcionará acesso a equipamentos de última geração e expertise em biologia estrutural, especialmente no processamento de conjuntos de dados complexos nos quais a possibilidade de partículas heterogêneas é provável, já que a troca completa de nucleotídeos pode não ser alcançada (ou seja, a separação dos estados de GDP e GTP pode ser necessária usando processamento avançado de imagens). Essa oportunidade me permitirá adquirir habilidades especializadas em crio-EM, contribuindo diretamente para a crescente capacidade do Brasil nessa área e avançando os esforços de pesquisa do nosso grupo, incluindo o uso do recém-instalado microscópio Tundra de 100 kV em São Carlos. Os resultados deste projeto deverão ter implicações amplas, oferecendo novos modelos para a dinâmica dos filamentos de septinas.