Caracterização funcional de genes do Sistema Ubiquitina Proteassoma de Leishmania infantum

• Processo: 24/17930-5
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Mestrado
• Data de Início da vigência: 01 de dezembro de 2024
• Data de Término da vigência: 30 de setembro de 2026
• Área de conhecimento: Ciências Biológicas - Parasitologia - Protozoologia de Parasitos
• Pesquisador responsável: Felipe Roberti Teixeira
• Beneficiário: Caroline Torres
• Instituição Sede: Centro de Ciências Biológicas e da Saúde (CCBS). Universidade Federal de São Carlos (UFSCAR). São Carlos , SP, Brasil
• Vinculado ao auxílio: 22/02933-3 - Papel do sistema ubiquitina proteassoma na proliferação, diferenciação e infectividade de Leishmania infantum, AP.PNGP.PI
• Assunto(s): Leishmania infantum Ubiquitinas Parasitologia molecular
• Palavra(s)-Chave do Pesquisador: E3 Ubiquitina ligases | leishmania infantum | Ubiquitina | Parasitologia molecular

Resumo

O sistema ubiquitina-proteassoma (SUP) é responsável pela maior parte da proteólise intracelular em eucariotos, sendo constituído por três enzimas: E1 (enzima ativadora de ubiquitina), E2 (enzima carreadora de ubiquitina) e as E3 (enzima ubiquitina-ligase). Essas enzimas atuam de maneira coordenada no processo de ubiquitinação, reconhecendo proteínas-alvo e transferindo ubiquitina a elas, direcionando-as, assim, para a degradação pelo proteassoma. Em protozoários parasitas, a proteólise intracelular é essencial para a alternância de hospedeiros em seus ciclos de vida e consequentemente crucial para o sucesso do parasitismo. Nos parasitos do gênero Leishmania, o SUP é fundamental para o seu ciclo de vida e proliferação sendo alvo farmacológico para o tratamento de leishmanioses, grupo de doenças negligenciadas que afetam milhões de pessoas no mundo. Entretanto, apesar da relevância do SUP para Leishmania, os estudos de caracterização de E3 ubiquitina-ligases nestes parasitos são escassos. Neste projeto, propomos caracterizar bioquimicamente os genes de L. infantum LINF_070009100, LINF_060005200, LINF_150022200, LINF_080017100 e LINF_280024600 que são ortólogos aos genes humanos TRAF6, COP1, SYVN, BRCA1 e Trim32 respectivamente, que são parte da classe de E3 ligases em humanos chamada single RING ligases. Diante disso, parasitos de L. infantum serão geneticamente modificados por meio da estratégia CRISPR-Cas9 para produção de linhagens nocautes, marcadas por uma sequência nucleotídica única (barcode). As linhagens viáveis serão reunidas em uma cultura promastigota única (pooled culture - PC) que será reunida a demais nocautes de outras proteínas do SUP e cultivadas em diferentes tempos (0, 24, 48 e 168h). Serão realizadas também a diferenciação de promastigotas em amastigotas e a infecção de macrófagos. Por meio do sequenciamento de nova geração dos produtos de PCR que amplificarão as regiões dos barcodes (Bar-seq), serão feitas análises de bioinformática avaliando os genes requeridos para o desenvolvimento dos parasitos em cada situação. Ainda por meio da estratégia CRISPR-Cas9, será feita a inserção de tags 3xmyc nestes genes para a caracterização bioquímica destas linhagens. Será realizada a identificação dos ligantes das proteínas codificadas por estes genes através de imunoprecipitação das proteínas ligadas ao 3xmyc tag, seguido de análise por espectrometria de massas para identificação dos ligantes. Buscaremos no interactoma das proteínas TRAF6, COP1, SYVN, BRCA1 e Trim32 de L. infantum outros potenciais componentes do SUP deste parasito. Por fim, ensaios para validação das interações proteína-proteína e ubiquitinação in vitro serão realizados. Esta proposta permitirá a caracterização de E3 ligases de L. infantum ortólogas a enzimas responsáveis por processos essenciais em H. sapiens, como apoptose, proliferação e divisão celular. Os resultados contribuirão para compreender a fisiologia do parasito e seus mecanismos celulares para interação parasito-hospedeiro, levando a identificação de potenciais alvos para intervenção farmacológica visando a descoberta de um tratamento efetivo para as leishmanioses.