Construção de vetores espécie específicos para aumento da eficiência na aquisição de células tronco de pluripotência induzida em modelos animais.

• Processo: 24/13586-8
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Mestrado
• Data de Início da vigência: 01 de fevereiro de 2025
• Data de Término da vigência: 31 de agosto de 2026
• Área de conhecimento: Ciências Agrárias - Medicina Veterinária - Reprodução Animal
• Pesquisador responsável: Fabiana Fernandes Bressan
• Beneficiário: Nayanne Sant Clair Cardoso da Silva
• Instituição Sede: Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos (FZEA). Universidade de São Paulo (USP). Pirassununga , SP, Brasil
• Assunto(s): Reprogramação celular
• Palavra(s)-Chave do Pesquisador: Células de pluripotência induzida | Construção de vetor de indução espécie específico | fibroblastos adultos | Modelo de estudos celulares para espécies domésticas e silvestres | Modulação da expressão gênica | reprogramação celular | Células de pluripotência induzida

Resumo

A produção e a pesquisa na área de células-tronco avançam rapidamente, sendo importante a geração de modelos que utilizem diversas espécies animais, tanto para a geração de novas tecnologias ou protocolos para animais como espécies alvo, ou como modelos. Uma vez adequadamente reprogramadas in vitro, linhagens celulares apresentam potencial de diferenciação em qualquer tecido do organismo, trazendo inúmeros benefícios à medicina regenerativa e reprodutiva, bem como alavanca estudos in vitro, permitindo maior compreensão dos mecanismos biológicos envolvidos no processo reprogramativo. Todavia, este processo pode não ser plenamente realizado dadas diferenças na sequências gênicas exógenas introduzidas no hospedeiro durante processo indutivo, em relação à sequência gênica da espécie de interesse. Neste estudo propõe-se, portanto, a construção de um vetor de indução à reprogramação celular contendo fatores de transcrição espécie-específicos (Oct4, Sox2, c-Myc, Lin 28, Nanog e Klf4) com a hipótese de permitir a reprogramação completa e aumentar a eficiência na aquisição de células tronco em espécies domésticas, convencionais e não convencionais, foco das pesquisas prévias no país. Para tal, serão realizadas uma clonagem gênica e a montagem de um vetor lentiviral que contenha os genes relacionados à pluripotência, primeiramente, da espécie modelo Gallus gallus, e o cultivo celular de fibroblastos fetais de galinha, da linhagem comercial DF-1 e, posteriormente, a caracterização das células pluripotentes induzidas (iPSC).O processo de construção do vetor de indução espécie específico terá início com a extração de RNA da espécie alvo, seguido da síntese de cDNA; reação em cadeia da polimerase para amplificação exponencial das sequências alvo; eletroforese utilizando primers construídos através da sequência genômica da espécie para revelar se tais segmentos apresentam o tamanho de pares de base esperado; purificação do gel para isolamento do fragmento de interesse; sequenciamento do tipo Sanger, para assegurar que os nucleotídeos apresentam conformação adequada; linearização do vetor escolhido (através dos sítios de enzimas de restrição) permitindo a ligação dos fragmentos (fatores de transcrição) e fechamento do vetor, que deverá então ser introduzido em bacterias competentes para a observação da formação de colônias bacterianas e posterior isolamento do conteúdo do plasmídeo que será utilizado para a produção viral.O processo de aquisição viral, por sua vez, contendo os fatores espécie específicos é dado através do uso de auxiliares que fornecem as proteínas estruturais e de replicação permitindo o empacotamento viral com conteúdo de interesse, que será entregue às células hospedeiras 293 FT, as quais fornecerão a maquinaria celular necessária para o processo replicativo e permitirão a formação de inúmeras cópias virais que serão ultra centrifugadas e concentradas para que possam ser traduzidas nas células adultas e induzam ao retorno do estado de pluripotência similar ao embrionário. Com isso, é esperado o sucesso na montagem de um vetor contendo sequências específicas de cDNAs de galinha relativos a genes relacionados à indução à pluripotência, sendo eles, OCT4, SOX2, c-myc, KLF4, Lin28 e Nanog. Ainda, que o vetor seja funcional o que será testado pela sua capacidade de reprogramação celular quando comparado ao vetor já disponível comercialmente, com cDNAs humanos.Bem como, é esperada a promoção da ampliação do conhecimento dos aspectos celulares e moleculares das células pluripotentes para posterior aplicação dessa tecnologia no aprimoramento de estudos celulares de outras espécies de interesse do grupo de pesquisa. Essa experiência será essencial para a otimização dos protocolos atuais para reprogramação completa em células animais, incluindo maior eficiência em relação à reprogramação induzida in vitro (geração de iPSCs) a partir de modelos diferentes de roedores e humanos.