Caracterização funcional de genes do Sistema Ubiquitina Proteassoma de Leishmania infantum

• Processo: 25/16692-6
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Mestrado
• Data de Início da vigência: 01 de setembro de 2025
• Data de Término da vigência: 31 de agosto de 2027
• Área de conhecimento: Ciências Biológicas - Parasitologia - Protozoologia de Parasitos
• Pesquisador responsável: Felipe Roberti Teixeira
• Beneficiário: Maria Júlia Mattos Gomes
• Instituição Sede: Centro de Ciências Biológicas e da Saúde (CCBS). Universidade Federal de São Carlos (UFSCAR). São Carlos , SP, Brasil
• Vinculado ao auxílio: 22/02933-3 - Papel do sistema ubiquitina proteassoma na proliferação, diferenciação e infectividade de Leishmania infantum, AP.PNGP.PI
• Assunto(s): Leishmania infantum Ubiquitinas
• Palavra(s)-Chave do Pesquisador: leishmania infantum | proteasoma | Ubiquitina | proteólise intracelular

Resumo

Através de análises de bioinformática buscando domínios estruturais conservados de proteínas e genes ortólogos do Sistema Ubiquitina Proteassoma (SUP) de Homo sapiens, identificamos 91 genes relacionados a este sistema em L. infantum. Este é o principal sistema de degradação intracelular de proteínas em mamíferos, sendo caracterizado pela ação de 3 enzimas que promovem a ubiquitinação dos seus substratos, denominadas E1 (enzima ativadora de ubiquitina), E2 (enzima conjugadora de ubiquitina) e E3 (ubiquitina ligases). Além destas, o proteassoma, um complexo multicatalítico proteico promove a degradação das proteínas poliubiquitinadas e a reciclagem dos aminoácidos para posterior síntese proteica no processo de tradução. Dentre os 91 genes, 3 são de enzimas E1, 15 de E2s e 47 genes de subunidades ou E3 ligases monoméricas subdivididas em: 15 componentes de CRLs, 5 Single RING ligases, 13 tipo HECT, 4 U-box, 9 componentes das APCs -Anaphase Promoting Complex e 1 RBR- RING between RING. Além disso, 3 reguladores das CRLs denominados COP9 signalossoma e 25 componentes do proteassoma foram identificados. Nenhum estudo bioquímico de caracterização do SUP em Leishmania infantum foi descrito na literatura até o momento. Nesta cota de MS, propomos a utilização da estratégia CRISPR-Cas9 para produção de linhagens nocautes de cada um dos 21 genes do proteassoma ortólogos aos de H. sapiens. Propomos ainda utilizar um sensor de atividade do proteassoma baseado em bioluminescência que já vem sendo desenvolvido em nosso grupo de pesquisa. As linhagens de parasitas nocautes serão marcados por uma sequencia nucleotídica única (barcode). As linhagens viáveis serão reunidas em uma cultura promastigota única denominada pooled culture (PC) que será cultivada em diferentes tempos (0, 24, 48 e 168h), diferenciadas em amastigotas (24 e 72h) ou usadas para infecção in vitro (12 e 72h). Através de análises quantitativas do sequenciamento de nova geração dos produtos de PCR que amplificarão as regiões contendo os barcodes (Bar-seq), obteremos através de análise bioinformática os genes requeridos para o desenvolvimento dos parasitos em cada situação. Estes genes serão caracterizados bioquimicamente através de ensaios de identificação de ligantes no parasito, interação proteína-proteína, microscopia confocal e susceptibilidade das linhagens produzidas a inibidores do proteassoma. Esta proposta permitirá a caracterização do principal sistema de proteólise intracelular de eucariotos em Leishmania infantum e seus resultados contribuirão para o entendimento da fisiologia do parasito e os mecanismos celulares envolvidos na interação parasito-hospedeiro, levando a identificação de potenciais alvos para intervenção farmacológica visando a descoberta de um tratamento efetivo para as leishmanioses.