Estudos sobre reconhecimento e regulação na guerra bacteriana mediada por sistemas de secreção do Tipo IV e sobre a regulação da polimerização do pilus do Tipo IV.

• Processo: 25/26425-5
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Doutorado Direto
• Data de Início da vigência: 01 de dezembro de 2025
• Data de Término da vigência: 30 de novembro de 2030
• Área de conhecimento: Ciências Biológicas - Bioquímica - Química de Macromoléculas
• Pesquisador responsável: Shaker Chuck Farah
• Beneficiário: Jonas Vieira Parise Bianchini
• Instituição Sede: Instituto de Química (IQ). Universidade de São Paulo (USP). São Paulo , SP, Brasil
• Vinculado ao auxílio: 21/10577-0 - Centro de Pesquisa em Biologia de Bactérias e Bacteriófagos (CEPID B3), AP.CEPID
• Assunto(s): Cristalografia Interação proteína-proteína Microbiologia molecular Xanthomonas citri Biologia estrutural
• Palavra(s)-Chave do Pesquisador: Cristalografia | CryoEM | Interação proteína-proteína | Microbiologia Molecular | Sistemas bacterianos de secreção de macromoléculas | Xanthomonas citri | Biologia Estrutural

Resumo

Este projeto possui dois principais objetos de estudo:1) Estudos sobre reconhecimento próprio/não-próprio e regulação na guerra bacteriana mediada por X-T4SS.XAC2611 é uma proteína rica em cisteína de 164 aa (17,1 kDa) com função desconhecida, codificada próxima ao locus cromossômico do X-T4SS de Xanthomonas citri (Alegria et al., 2005; Sgro et al., 2019). A análise de sequência indica que XAC2611 é uma lipoproteína, e a porção C-terminal (resíduos 62-156) codifica um domínio de função desconhecida (DUF) classificado como DUF4189. Além disso, análises genômicas revelam que homólogos de XAC2611 são codificados próximos ou dentro do locus de X-T4SS em todas as outras espécies de Xanthomonadales que possuem um X-T4SS (Sgro et al., 2019). Ensaios de microscopia de células de E. coli contendo o vetor pBBR-XAC2611-GFP produziram XAC2611-GFP no envelope celular, e XAC2611 produzida em células-alvo pode protegê-las contra a morte mediada por X-T4SS de X. citri (Gabriel Oka e Chuck Farah, dados não publicados). Assim, XAC2611 pode fornecer proteção intraespécie contra ataques mediados por X-T4SS. Outros dados não publicados de nosso grupo indicam que XAC2611 pode interagir com VirB5, uma subunidade do X-T4SS associada ao pilo extracelular. Essa interação pode ser importante para que espécies de Xanthomonadales distingam espécies homólogas de espécies heterólogas em encontros celulares físicos muito próximos. O principal objetivo deste projeto é estudar esse fenômeno de reconhecimento próprio/não-próprio relacionado ao X-T4SS em maior detalhe.2) A regulação da polimerização do pilus do Tipo IVA polimerização do pilus do Tipo IV é impulsionada pela hidrólise de ATP por uma ATPase citoplasmática (PilB), enquanto PilT e PilU (parálogos de PilB) participam da retração/despolimerização dos pili em Pseudomonas aeruginosa (Chiang et al., 2005; Chiang et al., 2008) e X. citri (Dunger et al., 2014). Além dessas ATPases, um canal de membrana externa formado por PilQ e uma "plataforma de membrana interna" composta pelas proteínas integrais PilC, PilN, PilO, PilP e pela proteína citoplasmática PilM formam o aparato de secreção. Os mecanismos pelos quais os T4Ps são regulados variam significativamente entre diferentes organismos modelo (P. aeruginosa, Neisseria spp., Synechocystis, Vibrio cholerae e Myxococcus xanthus), bem como em espécies de Xanthomonas.Nosso grupo caracterizou mutantes de X. citri com mutações nos genes para PilB e PilT (Dunger et al., 2014; Llontop et al., 2021). Também estudamos a interação tripartite entre PilB, a proteína adaptadora PilZ e o receptor de c-di-GMP FimX, tanto de X. citri (Guzzo et al., 2013; Llontop et al., 2021) quanto de P. aeruginosa (Llontop, Baldini e Farah, dados não publicados). Entretanto, a função da terceira ATPase menos compreendida, PilU, ainda não é bem entendida. Portanto, planejamos criar um mutante PilU em X. citri e caracterizar seus fenótipos em ensaios de motilidade, formação de biofilme e sensibilidade a fagos. Além disso, não há informações sobre proteínas que interajam com PilT e PilU em X. citri. Assim, planejamos realizar ensaios de duplo-híbrido usando PilT e PilU como iscas para identificar parceiros de interação que possam revelar vias de transdução de sinal que controlem a biogênese de T4P.Usaremos crio-EM para determinar as estruturas dos complexos PilB-PilZ-FimX de X. citri e P. aeruginosa. Também planejamos expressar e purificar as proteínas recombinantes PilT e PilU e, de maneira semelhante ao nosso trabalho anterior com PilB, estudar suas atividades ATPase e determinar suas estruturas 3D por cristalografia de raios X ou crio-EM.