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Caracterização genotípica de cepas de Fonseca pedrosoi por RFLP

Processo: 06/06361-1
Linha de fomento:Bolsas no Brasil - Iniciação Científica
Vigência (Início): 01 de abril de 2007
Vigência (Término): 07 de dezembro de 2007
Área do conhecimento:Ciências da Saúde - Farmácia
Pesquisador responsável:Rosario Dominguez Crespo Hirata
Beneficiário:Liliane Mayumi Yamamoto
Instituição-sede: Faculdade de Ciências Farmacêuticas (FCF). Universidade de São Paulo (USP). São Paulo , SP, Brasil
Assunto(s):Doenças endêmicas   Cromoblastomicose   Polimorfismo de fragmento de restrição   Fonsecaea pedrosoi   Reação em cadeia por polimerase (PCR)   Técnicas de laboratório clínico   Técnicas de genotipagem   Análise do polimorfismo de comprimento de fragmentos amplificados   Análise de sequência de DNA

Resumo

A cromoblastomicose é uma doença endêmica no Brasil, principalmente na zona rural, e é causada pela Fonsecaea pedrosoi e outros fungos demácios. Esses fungos apresentam significativo pleomorfismo o que pode dificultar a sua identificação. Recentemente desenvolvemos um método de PCR-duplex para detecção de F. pedrosoi util para a identificação de cepas com características morfologias inespecíficas ou mesmo detectar o agente diretamente em amostras biológicas. Outros métodos moleculares têm sido utilizados para a caracterização genotípica de cepas de fungos demácios para fins epidemiológicos e taxonômicos. O método de PCR-RFLP dirigido para a região genômica IT1-5.8S-ITS2-28S (ITS-RFLP) tem sido utilizado para detectar perfis de fragmentos de DNA caracteristicos (Fingerprinting) para diferenciação de espécies de fungos demácios. O presente estudo tem por objetivo a caracterização genotípica por RFLP de cepas de F. pedrosoi isoladas de pacientes com cromoblastomicose provenientes de diferentes regiões do Brasil. Também serão estudadas as relações entre os perfis de RFLP e as características fenotípicas em cepas isoladas durante o tratamento com itraconazol e os perfil de sensibilidade a antifúngicos in vitro. Serão estudadas cepas F. pedrosoi provenientes de diversas localidades do Brasil (n=40) e isoladas de pacientes em diferentes períodos de tratamento com itraconazol ou outros antifúngicos (n=40). Também serão avaliadas cepas de outros fungos demácios (n=20) com a finalidade de comparar os perfis de RFLP com o de F. pedrosoi. A identificação morfológica das cepas será realizada por técnica de microcultivo e o perfil de sensibilidade a antifúngicos será avaliado pelo método de microdiluição em caldo preconizado pelo NCCLS. O DNA genomico das cepas será extraído por método de extração com CTAB e a identificação molecular será realizada por PCR-duplex, métodos previamente otimizados no nosso laboratório. A caracterização genotípica das cepas será realizada por PCR-RFLP utilizando-se as enzimas de restrição DdeI e TaqI e os perfis diferentes serão também avaliados por sequenciamento de DNA. Os resultados deste estudo contribuirão para o conhecimento da diversidade genética de isolados de F. pedrosoi oriundos de diferentes regiões geográficas do Brasil e permitirá avaliar a sua relação com a variabilidade morfológica durante o tratamento com itraconazol in vivo e com o perfil de sensibilidade a antifúngicos in vitro.

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