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Otimização da produção de proteínas heterólogas em E.coli através da engenharia do vetor de expressão

Processo: 06/07128-9
Linha de fomento:Bolsas no Brasil - Iniciação Científica
Vigência (Início): 01 de abril de 2007
Vigência (Término): 31 de dezembro de 2008
Área do conhecimento:Ciências Biológicas - Bioquímica - Química de Macromoléculas
Pesquisador responsável:Richard John Ward
Beneficiário:Juliana Sanchez Alponti
Instituição-sede: Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto (FFCLRP). Universidade de São Paulo (USP). Ribeirão Preto , SP, Brasil
Assunto(s):Mutagênese   Engenharia de proteínas   Endo-1,4-beta-xilanases

Resumo

As xilanases são enzimas que atualmente, têm sido utilizadas em diversas aplicações biotecnológicas como, por exemplo, nas indústrias de papel e celulose (que utilizam condições de alta temperatura e alcalinidade). O uso desta enzima, principalmente na etapa de polpação da celulose durante a fabricação do papel, diminui o uso de processos a base de cloro e que são prejudiciais ao meio ambiente quando descartados em efluentes. Assim, o uso das xilanases termoestáveis visa substituir futuramente o emprego de agentes químicos clorados. Com a finalidade de estudar as xilanases foi desenvolvido em nosso laboratório um novo sistema de expressão de proteínas que recebeu o nome de pT7BSXA, e a meta do projeto atual é modificar esse vetor para assim, aumentar a produção de xilanase A em E.coli através de um acréscimo do número de cópias do vetor.Usando as técnicas de mutagênese sítio-dirigida, os sítios para enzimas de restrição ApaI e XhoI serão introduzidos flanqueando a origem de replicação ColE1 do vetor de expressão pT7BSXA. Através da aplicação de técnicas de "error-prone" PCR será gerada uma biblioteca randômica da região da origem de replicação denominada de ColE1. O vetor pT7BSXA possui uma cópia do gene que codifica a beta-lactamase, e então a seleção dos mutantes será feita através da resistência das células às diferentes concentrações do antibiótico ampicilina. Neste processo, os mutantes que crescem possuem um maior número de cópias de plasmídeos, e portanto um número maior de cópias de ambos os genes: o da beta-lactamase e o da xilanase A. A correlação esperada entre resistência ao antibiótico e produção elevada de xilanase A será avaliada usando testes da atividade dos mutantes selecionados na hidrólise de xilano.