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Análise comparativa da expressão de RNAm de aquaporinas em sapos hidratados e submetidos ao estresse hídrico

Processo: 09/11210-0
Linha de fomento:Bolsas no Brasil - Iniciação Científica
Vigência (Início): 01 de agosto de 2009
Vigência (Término): 31 de dezembro de 2010
Área do conhecimento:Ciências Biológicas - Fisiologia - Fisiologia Comparada
Pesquisador responsável:Fernando Ribeiro Gomes
Beneficiário:Tatiana Rossi Alvarez
Instituição-sede: Instituto de Biociências (IBB). Universidade Estadual Paulista (UNESP). Campus de Botucatu. Botucatu , SP, Brasil
Vinculado ao auxílio:06/54699-1 - Fragmentação das florestas, distribuição geográfica e evolução fisiológica em anuros neotropicais, AP.JP
Assunto(s):Anura   Balanço hídrico   Aquaporinas   Biologia molecular

Resumo

Anuros adultos estão constantemente expostos à perda de água por evaporação através de sua pele. Para adaptarem-se ao ambiente terrestre, eles desenvolveram vários sistemas osmoregulatórios. Muitos adultos não bebem água pela boca, absorvendo água pela mancha pélvica (região ventral), a qual é um tecido altamente permeável. A água também é reabsorvida da urina, pelos néfrons e pela bexiga urinária em resposta a arginina vasotocina (AVT).O movimento de água através da membrana plasmática ocorre por de canais de água gerados por proteínas integrais de membrana conhecidas como aquaporinas (AQPs), as quais impedem ou regulam a passagem de íons. Isso faz das AQPs um dos principais mecanismos fisiológicos para o controle osmótico. No projeto será analisada a expressão do RNAm das aquaporinas AQP 1, AQP 2, AQP2K e AQP 3, sendo as últimas AVT dependentes.Resultados previamente obtidos no laboratório, demonstraram a existência de variação inter-específica nas taxas de re-hidratação de três espécies de Rhinella, sendo que R. ornata apresentou taxas de re-hidratação significativamente menores que aquelas apresentadas por R. schneideri e R. icterica. Uma possível explicação para esta variação em taxas de re-hidratação poderia envolver diferenças na expressão de aquaporinas na mancha pélvica.Desta forma, o objetivo do projeto é identificar e quantificar a expressão do RNAm de aquaporinas do tipo 1 e do tipo 2 (AVT dependentes) nos seguintes tecidos: cérebro, pele dorsal, pele ventral (mancha pélvica), bexiga urinária, intestino e rins de espécimes de R.. schneideri e R. ornata totalmente hidratados e após submissão à desidratação por um período de 7 dias. As hipóteses a serem testadas são: 1) R. schneideri apresenta maior expressão de RNAm de AQPs que R. ornata quando totalmente hidratados; 2) após o estresse osmótico, a expressão de RNAm de AQPs aumenta significativamente nas duas espécies; e 3) o aumento as expressão de RNAm de AQP após o estresse osmótico é muito maior em R. schneideri quando comparada à R. ornata.Plano de trabalhoInicialmente, a coleta dos animais, machos das espécies R. ornata e R. schneideri será realizada no município de Botucatu, São Paulo. No laboratório de Ecofisiologia Evolutiva sob orientação do Prof. Dr. Fernando Ribeiro Gomes os animais serão divididos em um grupo controle (n = 5-10 R. ornata e n = 5-10 R. schneideri) e um grupo tratado (n = 5-10 R. ornata e n = 5-10 R. schneideri), sendo que os animais deste grupo serão mantidos por 7 dias sem água, tendo sua massa medida diariamente e então eutanasiados utilizando-se dietileter para a retirada dos tecidos.A partir destas amostras serão conduzidos os experimentos que envolvem expressão gênica, a serem desenvolvidos no Laboratório de Fisiologia Molecular Ovariana, com a colaboração do Prof. Dr. José Buratini Jr. e do Doutorando Anthony C. Castilho.Expressão gênica e Análise dos dados de PCR em tempo realA expressão do RNAm das aquaporinas AQP1, AQP2, AQP2K e AQP3 nos tecidos extraídos dos animais controle e tratados será realizada pela técnica de RT-PCR em tempo real utilizando sistema de detecção Sybr Green.. Diferenças na taxa de expressão dos genes serão normalizadas pela expressão do controle endógeno (beta actina). A expressão relativa dos genes alvos será determinada pelo método de Pfaffl. O efeito tratamento sobre a expressão dos genes alvos será analisada por ANOVA, com testes a posteriori se necessário.