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Identificação do gene, clonagem e expressão da proteína trf2 de Leishmania amazonensis (la trf2)

Processo: 07/50621-0
Linha de fomento:Bolsas no Brasil - Iniciação Científica
Vigência (Início): 01 de abril de 2007
Vigência (Término): 31 de dezembro de 2009
Área do conhecimento:Ciências Biológicas - Genética - Genética Molecular e de Microorganismos
Pesquisador responsável:Maria Isabel Nogueira Cano
Beneficiário:Marcelo Santos da Silva
Instituição-sede: Instituto de Biociências (IBB). Universidade Estadual Paulista (UNESP). Campus de Botucatu. Botucatu , SP, Brasil
Assunto(s):Leishmania

Resumo

As proteínas da família TRF2 fazem parte de complexos multiproteicos responsáveis pela manutenção dos telômeros de alguns eucariotos. Elas apresentam domínios funcionais que a caracterizam como proteínas que interagem com DNA telomérico na forma de dupla fita: domínio de interação com o DNA (Myb-like), domínio acídico N-terminal e domínio de homodimerização (TRFH). A proteína TRF2 também está envolvida na formação de estruturas teloméricas terminais denominadas "t-loops". O intuito deste projeto é identificar e caracterizar uma proteína homóloga a proteína telomérica TRF2 em Leishmania. Será realizada uma busca no banco de dados público de L. major para se obter uma seqüência homóloga aos genes de Trypanosoma brucei (TbTRF2) e Homo sapiens (hTRF2). Utilizaremos a seqüência putativa da TRF2 de L.major para elaboração de iniciadores para amplificação da seqüência de L. amazonensis (LaTRF2) e dos mutantes deletérios (Myb e AMyb). Os produtos de amplificação serão clonados e seqüenciados e novos iniciadores serão elaborados de forma a permitir a clonagem da proteína inteira, e de seus domínios funcionais; em vetor de expressão bacteriana. Caso a proteína recombinante se mostre insolúvel neste sistema, procederemos com a subclonagem e expressão em sistema baculovirus. Verificaremos a expressão do gene e da proteína LaTRF2 utilizando RT-PCR, "Western Blot" e imunofluorescência. Esses polipeptídeos serão testados posteriormente em ensaios de interação proteína-DNA in vitro. (AU)