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Desenvolvimento de metodologia para elminação de LPS durante a produção de proteína recombinante

Processo: 05/01416-0
Linha de fomento:Bolsas no Brasil - Iniciação Científica
Vigência (Início): 01 de agosto de 2005
Vigência (Término): 31 de julho de 2006
Área do conhecimento:Ciências Biológicas - Bioquímica - Biologia Molecular
Pesquisador responsável:Arlete Aparecida Martins Coelho-Castelo
Beneficiário:Thiago Malardo
Instituição-sede: Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto (FMRP). Universidade de São Paulo (USP). Ribeirão Preto , SP, Brasil
Assunto(s):Biotecnologia   Proteínas recombinantes   Lipopolissacarídeos   Escherichia coli

Resumo

O desenvolvimento das técnicas de Biologia Molecular, a partir da década de 70, impulsionou várias áreas da pesquisa acadêmica e tecnológica.Do ponto de vista da produção de proteínas recombinantes, possibilitou a produção em larga escala de insumos utilizados na saúde humana, como a Insulina e o Hormônio de Crescimento. Em geral, a produção em larga escala, envolve a utilização de leveduras transformadas com o DNA da proteína em questão. A produção em menor escala, e economicamente mais viável para laboratórios, utiliza cepas bacterianas Gram-negativas devidamente engenheiradas para tal fim. A bactéria transformada com o DNA da proteína a ser produzida para ensaios laboratoriais é mantida armazenada a -70ºC até o momento de uso. Atualmente, dependendo do vetor utilizado para transferir o DNA para a bactéria, se dispõe de diversos processos cromatográficos para a purificação da proteína recombinante. No entanto, para ensaios imunológicos, a presença de pouca quantidade de LPS co-purificado da parede dessas bactérias, já é capaz de fornecer resultados falsos positivos. Assim o sistema de purificação da proteína tem que eliminar totalmente o conteúdo de LPS, para impedir que ele atue nas células do sistema imune. Nós trabalhamos com uma proteína que a capacidade de se ligar ao LPS (hsp65 de Mycobacterium leprae), o que dificulta a eliminação de todo resíduo dessa endotoxina da cultura bacteriana. Assim a proposta do presente trabalho e retirar o LPS da parede bacteriana, com diferentes tratamentos, antes de lisar a cultura para posterior purificação da proteína em colunas com polihistidina. A retirada do LPS impedirá que, no momento de lise, a proteína recombinante tenha contato com esse componente, e facilite o processo de purificação gerando amostras livres de LPS.