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"caracterização estrutural e funcional da atividade ascorbato-peroxidásica das 1-Cys peroxirredoxinas"

Processo: 07/06680-2
Linha de fomento:Bolsas no Brasil - Iniciação Científica
Vigência (Início): 01 de janeiro de 2008
Vigência (Término): 31 de dezembro de 2010
Área do conhecimento:Ciências Biológicas - Bioquímica - Biologia Molecular
Pesquisador responsável:Gisele Monteiro
Beneficiário:Lucas de Sousa Cavalcante
Instituição-sede: Instituto de Biociências (IB). Universidade de São Paulo (USP). São Paulo , SP, Brasil
Assunto(s):Aminoácidos essenciais   Estrutura   Peroxirredoxinas

Resumo

Peroxirredoxinas (Prx) são enzimas presentes nos mais diversos grupos taxonômicos e são capazes de reduzir peróxidos orgânicos, peróxido de hidrogênio e peroxinitrito. Em seu sítio ativo, possuem uma cisteína reativa na forma de tiolato (RS-), que é estabilizada, em sua estrutura terciária, por aminoácidos carregados positivamente. As Prxs podem ser classificadas em 1-Cys (que possuem uma cisteína reativa envolvida no ciclo catalítico) e 2-Cys (que possuem duas cisteínas envolvidas no ciclo catalítico). Peroxirredoxinas são conhecidas por serem estritamente dependentes de redutores tiólicos, porém Monteiro et al., 2007, revelaram que as 1-Cys Prxs podem também utilizar ascorbato como redutor, mudando o paradigma de que as Prxs são enzimas dependentes de tiól. O propósito desse projeto é estudar essa propriedade, a fim de compreender quais os mecanismos e quais características estruturais permitem às 1-Cys e não às 2-Cys utilizar o ascorbato como redutor. Pretendemos ainda fazer análises comparativas de cavidade do sítio ativo e com isso estudar outras proteínas que podem possuir o par ácido sulfênico / ascorbato como mediadores. Extratos protéicos de mamífero e levedura serão testados quanto à concentração de ácido sulfênico após tratamento com peróxido e após subseqüente incubação por ascorbato. Dessa forma, poderemos estimar a abrangência do par redox ácido sulfênico – ascorbato na modulação redox celular. Através de estudos do docking do ascorbato com rPrdx6 (uma 1-Cys Prx de humano), pudemos verificar quais aminoácidos devem estar envolvidos na condensação do ácido sulfênico da cisteína reativa pela vitamina C. São eles: His39, Thr44, Arg132 e Thr192. Com esses resultados, realizamos mutação sítio-dirigida do resíduo His39, substituindo-o por uma serina. Por meio de ensaios de proteção a glutamina sintetase com rPrdx6, utilizando DTT e ascorbato como redutores no sistema, verificamos uma significativa diminuição de atividade do mutante rPrdx6 H39S em relação à proteína selvagem, especialmente na presença de ascorbato, o que indica que esse resíduo de histidina, altamente conservado nas 1-Cys Prxs, tem papel importante na atividade ascorbato-peroxidásica de rPrdx6. Pretendemos realizar novas mutações e outros ensaios enzimáticos com mutantes de rPrdx6 para assim compreender a função desse novo par redox.

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