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Replicação do vírus da febre amarela: mapeamento das interações proteína-proteína entre NS5 e proteínas celulares através de mutagênese sítio dirigida

Processo: 08/05101-1
Linha de fomento:Bolsas no Brasil - Iniciação Científica
Vigência (Início): 01 de julho de 2008
Vigência (Término): 31 de agosto de 2009
Área do conhecimento:Ciências Biológicas - Microbiologia - Biologia e Fisiologia dos Microorganismos
Pesquisador responsável:Maurício Lacerda Nogueira
Beneficiário:Mariana Pela Sabbag
Instituição-sede: Faculdade de Medicina de São José do Rio Preto (FAMERP). Secretaria de Desenvolvimento Econômico (São Paulo - Estado). São José do Rio Preto , SP, Brasil
Vinculado ao auxílio:04/11098-2 - Vírus da febre amarela: diagnóstico, aspectos moleculares e interferência de RNA, AP.JP
Assunto(s):Flavivirus   Interação proteína-proteína   Virologia   Febre amarela

Resumo

Inicialmente neste projeto JP haveria 3 bolsistas IC, sendo 2 para a área de interações proteína-proteína e um para vigilância de Flavivírus. Devido a concessão de uma bolsa PIBIC/CNPq para este laboratório e a diminuição de casos de flavivíroses no nosso município esta terceira bolsa ficou sem uso até o momento. A linha de pesquisa de interações tem tomado uma importância maior neste momento e com esta oportunidade gostaríamos de incluir mais um bolsista nesta linha. A candidata a esta bolsa tem sido estagiário com excelente desempenho e se juntaria com os outros 2 bolsistas IC para a conclusão deste projeto. Desta forma a bolsista atuaria em mais uma frente, sendo responsável pela geração de mutantes em NS5 para caracterizar as interações entre NS% e EIF6S3IP, U1A, p54nrb e SNF5 (INI).Plano de Atividades Para as bolsas 1 e 3 (Já em andamento)A bolsista 1 já se encontra em andamento até dezembro. Este plano descreve as atividades que serão realizadas até o fim das atividades da bolsista em andamento e serão complementadas pela próxima bolsista.Cada uma das bolsistas trabalhará com uma proteína a ser definida após os processos de caracterização da interação in vitro. Ou seja, serão realizados experimentos de pull-down e co-imunoprecipitação com as proteínas EIF6S3IP, U1A, p54nrb e SNF5 (INI). Após estes experimentos cada bolsista trabalhará com uma proteína.Plano de Atividades Para as bolsas 2 (Esta solicitação)Geração de mutuantes em NS5 através de mutagênese sítio dirigida e caracterização da interação entre NS5 mutante e as proteínas celulares EIF6S3IP, U1A, p54nrb e SNF5 (INI) através de duplo-híbrido.Título:Análise de novas interações proteína-proteína entre NS5 de febre amarela e proteínas celularesResumo e ObjetivoInterações proteína-proteína são fenômenos essenciais para a regulação de diversos fenômenos biológicos. A replicação viral é essencialmente dependente da interação entre proteínas celulares e virais. Dados obtidos em nosso laboratório mostram que o domínio RNA polimerase da proteína NS5 de febre amarela interage com diversas proteínas celulares através de estudo de duplo híbrido. O objetivo deste trabalho é caracterizar a interação entre NS5 e proteínas celulares in vitro e in vivo.Plano de Trabalho incluindo Metodologia As proteínas identificadas no screening de duplo-híbrido e previamente selecionadas (EIF6S3IP, U1A, p54nrb e SNF5) serão caracterizadas para a sua interação com NS5 através de experimentos in vitro e in vivo. Para isto realizaremos:1 - GST - pull down. A proteína NS5 expressada em bactéria na sua forma GST-tagged e formas His-tag de EIF6S3IP, U1A, p54nrb e SNF5 (também expressas em bactéria) serão utilizadas para pull down com colunas de afinidade para GST. A revelação da interação será feita por Western Blot.2 - Co-imunoprecipitaçãoAs proteínas NS5 e seus parceiros serão expressos em células de eucarioto e co-imunoprecipitadas através de etiquetas HA e FLAG. A revelaçãos era realizada por western blot.3 - Caracterização da interação entre as proteínas EIF6S3IP e SNF5 e o fragemnto de A de outros flavivírusO fragmento A correspondente de Dengue e SLE serão clonados em pGBKT7 e terá testada sua capacidade de interação com as proteínas EIF6S3IP e SNF5 através de duplo-híbrido. Caso positivo será também caracterizado através de GST-pul down.4- Geração de mutantes e sua análise (atividade desta bolsista)Conforme projeto em anexo

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