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Estudo de relações moleculares de tpxi-trxii de Saccharomyces Cerevisiae através da obtenção de complexos proteicos estáveis

Processo: 08/10004-5
Linha de fomento:Bolsas no Brasil - Iniciação Científica
Vigência (Início): 01 de abril de 2009
Vigência (Término): 30 de novembro de 2010
Área do conhecimento:Ciências Biológicas - Bioquímica - Biologia Molecular
Pesquisador responsável:Marcos Antonio de Oliveira
Beneficiário:Larissa Yukie Kido
Instituição-sede: Universidade Estadual Paulista (UNESP). Campus Experimental do Litoral Paulista. São Vicente , SP, Brasil
Vinculado ao auxílio:07/50930-3 - Análise funcional e estrutural de proteínas antioxidantes dependentes de tióis: uma investigação de mecanismos moleculares de catálise e da formação de complexos protéicos contendo dissulfetos mistos, AP.JP
Assunto(s):Tiorredoxinas   Saccharomyces cerevisiae   Eros

Resumo

A maioria dos organismos existentes no planeta vive em ambientes aeróbicos, utilizando o oxigênio em uma variedade de reações oxidativas pertencentes ao metabolismo celular normal. A redução incompleta do oxigênio gera moléculas intermediárias, ou até mesmo subprodutos, denominadas Espécies Reativas de Oxigênio (EROs), que quando ultrapassam a capacidade antioxidante da célula provocam o estresse oxidativo, devido a sua habilidade de causar danos a um grande número de biomoléculas (lipídeos, proteínas e DNA). Para combater os danos ocasionados por EROs, os organismos desenvolveram defesas antioxidantes capazes de remover e reparar os danos causados por EROs que inclui enzimas antioxidantes as quais são capazes de decompor as EROs. Dentre essas enzimas antioxidantes, as Tiorredoxinas Peroxidases (TPxs) tem sido amplamente estudadas devido a sua eficiência, abundância e distribuição entre os diversos compartimentos celulares de eucariotos (citoplasma, mitocôndria, núcleo e cloroplasto), apresentando-se muito conservada dentre os diferentes filos e reinos. Em Saccharomyces cerevisiae, um organismo modelo para estudos bioquímicos e genéticos de eucariotos, já foram descritas cinco isoformas de tiorredoxinas peroxidase, as citosólicas (cTPxI, cTPxII e cTPxIII), a mitocondrial (mTPx) e a nuclear (nTPx). A atuação dessas proteínas antioxidantes diz respeito à capacidade de decompor H2O2, peróxidos orgânicos e peróxinitritos durante seu ciclo catalítico, utilizando de duas cisteínas altamente reativas presentes em seus sítios ativos para efetuar as reduções. Com a redução dos peróxidos as cisteínas da TPx formam um dissulfeto, o qual necessita ser reduzido para que a proteína possa realizar uma nova catálise. Grande parcela das TPxs tem suas cisteínas reduzidas pelas tiorrexinas (Trx), que efetuam a redução doando elétrons oriundos de dois resíduos de cisteínas presentes em seu sítio ativo. Adicionalmente à redução das TPxs, as Trxs estão envolvidas em diversos processos biológicos como ativação de fatores de transcrição, metabolismo de enxofre, redução de nucleotídeos, dentre outros, o que demonstra sua grande importância na manutenção da homeostase celular. Como mencionado anteriormente, a transferência de equivalentes redutores entre Trx e a TPx é feito pelas cisteínas presentes em seus sítios ativos e durante este processo existe a formação de uma ligação dissulfeto transiente entre elas. Em S. cerevisiae, também já foram descritas três Trxs, sendo duas citosólicas (TrxI e TrxII) e uma mitocondrial (TrxIII). Neste contexto, as interações entre cTPxI e TrxI aparenta ter grande importância biológica uma vez que cTPxI é uma das enzimas mais abundantes neste organismo respondendo por até 0.8% de todas as proteínas solúveis da célula e, apesar de poder ser reduzida por ambas Trx citoplasmáticas, estudos recentes demonstram que cTPxI é reduzida mais eficientemente pela TrxII. Este projeto tem por objetivo contribuir para um melhor entendimento das relações moleculares entre cTPxI e TrxII. Para atingir nossos objetivos serão padronizados metodologias de purificação por meio de cromatografia de afinidade por metais de proteínas cTPxI e TrxII carreando substituições específicas de determinados resíduos cisteína por serina (cTPxIC170S e TrxIIC34S), a obtenção de complexos protéicos estáveis unidos por dissulfetos mistos e a purificação destes complexos com alto grau de pureza e em quantidades suficientes que poderão ser utilizados posteriormente em experimentos de cristalização de proteínas.

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