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Estudos estruturais e bioquímicos de XAC3230, um possível fator de virulência da família NAD:arginina ADP ribosiltransferase do fitopatógeno Xanthomonas axonopodis pv citri

Processo: 08/00669-0
Linha de fomento:Bolsas no Brasil - Iniciação Científica
Vigência (Início): 01 de abril de 2008
Vigência (Término): 30 de setembro de 2009
Área do conhecimento:Ciências Biológicas - Bioquímica - Química de Macromoléculas
Pesquisador responsável:Shaker Chuck Farah
Beneficiário:Clarissa Ribeiro Reily Rocha
Instituição-sede: Instituto de Química (IQ). Universidade de São Paulo (USP). São Paulo , SP, Brasil
Vinculado ao auxílio:05/59243-3 - Análise estrutural e funcional de sistemas multiprotéticos para a patogenicidade de Xanthomonas axonopodis pv. citri, AP.TEM
Assunto(s):Fatores de virulência   Biologia estrutural   Cristalografia de proteínas   Proteínas   Toxinas bacterianas

Resumo

Descobrimos recentemente que o genoma de Xac codifica para uma proteína, XAC3230, homólogo ao HopU1, HopO1-1 e HopO1-2, fatores de virulência de Pseudomonas syringae pv. tomato. Estas proteínas pertencem a família de NAD:arginina ADP ribosiltransferase (ART) que modificam covalentemente grupos arginina em proteínas alvo. Muitas toxinas bacterianas possuem esta atividade (ex: toxinas de cholera, de pertussis e de diftéria). HopU1, HopO1-1 e HopO1-2 são secretados pelo sistema de secreção do tipo III (T3SS) de P. syringae e foi recentemente demonstrado que HopU-1 suprime a imunidade do hospedeiro por meio de modifição de proteínas alvos da planta que se ligam a RNA. XAC3230 possui uma alta identidade, na sua porção amimo-terminal, com XAC0011 e XAC0286, fatores de virulência possivelmente secretadas pelo sistema de secreção do tipo III em Xanthomonas. Esta sequência N-terminal é provavelmente necessária para sua secreção pela T3SS. XAC3230 nunca foi caracterizada e não foi identificada como possivel fator de virulência de Xanthomonas em estudos anteriores. Até o momento, não há nenhuma estrutura de um fator de virulência da família ART derivada de um fitopatôgeno bacteriana.Este projeto tem como objetivo expressar, purificar, cristalizar e determinar a estrutura da proteína XAC3230. Ensaios enzimáticos com a proteína recombinante purificada também serão executados. Finalmente, será produzida uma cepa de Xac em que o gene xac3230 está nocauteado. Para tanto as seguintes etapas serão realizadas: a) Clonagem e expressão do gene que codifica a proteína de interesse; b) Purificação da proteína para fins de cristalização e verificação da sua atividade; c) Ensaios enzimáticos de atividade NAD:arginina ADP ribosiltransferase; d) Cristalização da proteína purificada; e) Determinacao de sua estrutura tridimensional; f) Obtenção de knockout e subsequente complementação com o gene tipo selvagem e um gene mutante; g) Teste em plantas suceptíveis a infecção pelo fitopatógeno tipo selvagem e mutante.

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