Análise da afinidade dos subsítios de uma alfa-amilase de mutante de Bacillus stearothermophilus

• Processo: 00/09918-0
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Iniciação Científica
• Data de Início da vigência: 01 de outubro de 2000
• Data de Término da vigência: 12 de agosto de 2001
• Área de conhecimento: Ciências Biológicas - Bioquímica - Biologia Molecular
• Pesquisador responsável: Ana Claudia Rasera da Silva
• Beneficiário: Isabel de Mattos Marcondes
• Instituição Sede: Instituto de Química (IQ). Universidade de São Paulo (USP). São Paulo , SP, Brasil
• Vinculado ao auxílio: 95/09307-1 - Estudo das interações entre aminoácidos e ligantes na determinação das propriedades catalíticas das enzimas, AP.JP
• Assunto(s): Amilases alfa-Amilases Bacillus stearothermophilus Aspergillus oryzae
• Palavra(s)-Chave do Pesquisador: Alfa-Amilase

Resumo

A família das alfa-amilases possui variado perfil de ligação de substrato e de padrão de clivagem. Amilases de B. stearothermoplhilus, por exemplo, clivam amido em açúcares maiores que os que são fruto da clivagem das enzimas de A oryzae. Para estudar os determinantes desta diferença de especificidade, substituiu-se, na enzima bacteriana, alguns resíduos topologicamente correspondentes encontrados na amilase fúngica. Esperando, desta forma, que as propriedades catalíticas das enzimas tornassem-se semelhantes. As mutações pontuais foram realizadas e os respectivos mutantes foram analisados em um trabalho anterior. O mutante mais interessante, de propriedades catalíticas mais parecidas com as de enzimas fúngicas, foi o S267D, formado pela substituição do resíduo S267 por um aspartato. Este projeto pretende, então, estudar as afinidades dos subsítios deste mutante em relação à enzima selvagem. O cálculo das afinidades de cada subsítio será realizado a partir de parâmetros cinéticos (Km e Vm), obtidos experimentalmente para uma série de substratos que apresentam níveis de polimerizações, que variam entre 2 e o número de subsítios da enzima. Utilizaremos, também, uma série de substratos marcados para sabermos o padrão de clivagem das enzimas, e onde o substrato se encaixa no sítio ativo, em relação à posição dos resíduos catalíticos. A partir dos dados obtidos, saberemos se uma única mutação é capaz de mudar o padrão catalítico de uma enzima. (AU)