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Efeito de ácidos graxos sobre a sensibilidade a insulina em cultura de células musculares esqueléticas: fosforilação de proteínas, expressão de genes e atividade de PPARs

Processo: 05/00807-5
Linha de fomento:Bolsas no Brasil - Pós-Doutorado
Vigência (Início): 01 de outubro de 2005
Vigência (Término): 31 de maio de 2007
Área do conhecimento:Ciências Biológicas - Fisiologia - Fisiologia de Órgãos e Sistemas
Pesquisador responsável:Rui Curi
Beneficiário:Sandro Massao Hirabara
Instituição-sede: Instituto de Ciências Biomédicas (ICB). Universidade de São Paulo (USP). São Paulo , SP, Brasil
Assunto(s):Ácidos graxos   Sistema musculoesquelético   Resistência à insulina   Expressão gênica   Endocrinologia   Receptores ativados por proliferador de peroxissomo

Resumo

A resistência à insulina ocorre em situações como obesidade e diabetes mellitus tipo 2. Nestas condições, também é observado aumento de ácidos graxos (AG) livres no plasma e, por este motivo, tem sido postulado seu envolvimento no estabelecimento da resistência à insulina. Contudo, o mecanismo pelo qual esta resistência se desenvolve, bem como a participação dos AG, ainda não estão bem estabelecidos. O nosso grupo demonstrou que os AG podem interferir com o metabolismo de glicose em células musculares esqueléticas (CME) através do ciclo de Randle e da via de sinalização à insulina. O presente projeto tem como objetivo determinar se os efeitos de diferentes AG sobre a sensibilidade e sinalização à insulina estão relacionados com alteração na expressão de genes, metabolismo mitocondrial e atividade de receptores ativados por proliferadores de peroxissomas (PPARs) nas CME. Serão utilizados dois tipos celulares: a) cultura de CME C2C12 e b) cultura primária de CME de ratos. Os AG a serem testados são: caprílico (C8:0), palmítico (C16:0), esteárico (C18:0), oleico (C18:1), linoleico (C 18:2), eicosapentaenóico (C20:5) e docosa-hexaenóico (C22:6). As CME serão cultivadas na presença de 100 microM dos diferentes AG por até 48 h. Ao término desse período, os seguintes parâmetros serão avaliados: 1) metabolismo de glicose (captação de 2-desoxi-[2,6-3H]-D-glicose e síntese de [14C]-glicogênio); 2) sinalização à insulina (fosforilação do receptor da insulina [IR], substrato para o receptor da insulina-1 e -2 [IRS-1 e –2], proteína quinase B [PKB ou Akt], glicogênio sintase quinase-3 [GSK-3], proteínas quinases ativadas por mitogénos [MAP quinases] p44 e p42, proteína-tirosina fosfatase-1B [PTP-1B], phosphatase containing SH2 [SHP-2], leukocyte antigen-related [LAR] e proteínas quinases C [PKC]); 3) expressão de genes envolvidos no metabolismo de glicose e AG (transportador de ácido graxo [FAT/CD36], proteína ligante de ácido graxo [FABP], transportador-4 de glicose [GLUT-4], acil-CoA sintase [ACS], piruvato desidrogenase quinase-4 [PDK-4], transportador de monocarboxilato-1 [MCT-1], carnitina palmitoil transferase-1 [CPT-1] e proteínas desacopladoras-2 e -3 [UCP-2 e –3]); 4) metabolismo mitocondrial (produção de NAD(P)H e ATP e acoplamento mitocondrial) e 5) atividade e expressão de PPARs. Para avaliar o metabolismo de glicose, as CME serão incubadas por uma hora em tampão bicarbonato de Krebs-Ringer contendo 5,6 mM de glicose, 0,3 microCi/mL de [U-14C]-D-glicose e 0,2 microCi/mL de 2-desoxi-[2,6-3H]-D-glicose, na ausência ou presença de insulina. Ao final da incubação, as CME serão congeladas em nitrogênio líquido e submetidas à mensuração da captação de 2-desoxi-[2,6-3H]-D-glicose e síntese de [14C]-glicogênio. O efeito dos AG sobre a sinalização à insulina será avaliado pela técnica de western blotting, através do uso de anticorpos específicos anti-IR, anti-IRS-1 e -2, anti-fosfotirosina, anti-fosfo-MAP quinases p44 e p42, anti-fosfo-Akt, anti-fosfo-GSK-3, anti-PTP-1B, anti-SHP-2, anti-LAR e anti-fosfo-PKC. A expressão de genes será determinada por PCR em tempo real. A produção de NAD(P)H será avaliada por fluorometria e a de ATP por espectrofotometria. O acoplamento mitocondrial será analisado utilizando rodamina 123 como marcadora fluorescente. Desta forma, determinar-se-á se a modulação da sensibilidade e sinalização à insulina pelos diferentes AG está relacionada com alterações na expressão de genes, atividade mitocondrial e de PPARs em CME. (AU)