Clonagem do gene TcPEPCK e expressão da enzima fosfoenalpiruvato carboxiquinase de Trypanosoma cruzi em E.coli

• Processo: 10/12541-8
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Iniciação Científica
• Data de Início da vigência: 01 de dezembro de 2010
• Data de Término da vigência: 30 de novembro de 2011
• Área de conhecimento: Ciências Biológicas - Bioquímica - Química de Macromoléculas
• Pesquisador responsável: Dulce Helena Ferreira de Souza
• Beneficiário: Beatriz Nogueira Messias de Miranda
• Instituição Sede: Centro de Ciências Exatas e de Tecnologia (CCET). Universidade Federal de São Carlos (UFSCAR). São Carlos , SP, Brasil
• Assunto(s): Desenho de drogas Proteínas recombinantes
• Palavra(s)-Chave do Pesquisador: Cruzi | Desenho de drogas | fosfoenalpiruvato carboxiquinase | proteína recombinante | T | bioquimica

Resumo

A doença de Chagas, causada pelo protozoário Trypanosoma cruzi, afeta aproximadamente 20 milhões de pessoas principalmente nas Américas do Sul e Central e é uma das chamadas doenças negligenciadas. O vetor de transmissão é um inseto vulgarmente conhecido como "barbeiro" que a noite ou durante o dia em ambiente escuro, saem de seus esconderijos, normalmente frestas de parede, colchões, tetos de palha ou barro, para sugar o sangue das partes descobertas do mamífero hospedeiro. A transmissão do protozoário se dá através das fezes do inseto, e uma vez infectado, o indivíduo passa por duas etapas da doença: a fase aguda e a fase crônica. No estágio final da doença, a deficiência cardíaca e as inflamações gastrointestinais resultam em 10% de casos fatais. O fato dos medicamentos utilizados no combate a doença de Chagas não serem efetivos e causarem graves efeitos colaterais (como anorexia, perda de peso, hiperexcitabilidade e depressão medular, vertigens, cefaleia e dores abdominais) motiva o desenvolvimento de novas drogas que sejam efetivas e menos tóxicas. O desenvolvimento de novas drogas requer o total conhecimento do ciclo de vida e dos mecanismos metabólicos do T. cruzi. Um dos caminhos para o desenvolvimento de novas drogas contra a doença de Chagas é explorar o fato de que a forma infectante de T. cruzi depende exclusivamente da via glicolítica como fonte de energia. Portanto, compostos que bloqueiem a glicólise podem ser utilizados como drogas para combater a doença. Uma abordagem da busca de compostos com potenciais capacidades inibidoras de enzimas, é a varredura (screening) de bibliotecas combinatórias e de bibliotecas de compostos naturais. A enzima fosfoenolpiruvato carboxiquinase (PEPCK) é a enzima da via glicolítica que catalisa reversivelmente a carboxilação do fosfoenolpiruvato e sua desfosforilação, com formação de oxaloacetato (OAA). Em estudos anteriores a enzima PEPCK de T.cruzi foi expressa e teve sua estrutura tridimensional determinada (Trapani et al., 2001). Devido ao fato da enzima ser expressa sem fusão foram necessárias cinco etapas de purificação, o que resulta em baixo rendimento. Além disso, algumas das resinas utilizadas foram descontinuadas, o que inviabiliza o uso do protocolo anteriormente desenvolvido. A busca de inibidores para a PEPCK de T.cruzi é um dos projetos inseridos no Instituto Nacional de Biotecnologia Estrutural e Química Medicinal em Doenças Infecciosas (INBEQMeDI-INCT/CNPq), que é coordenado pelo Prof. Dr. Glaucius Oliva, do Instituto de Física da USP, São Carlos. Para que a enzima PEPCK possa ser ensaiada contra os possíveis inibidores, é necessário que esta seja expressa na forma solúvel, purificada em grau de pureza elevado e que seja estabelecida uma metodologia para o screening dos compostos. Assim, no presente projeto de IC propomos a clonagem do gene Tcpepck em um vetor que permita a expressão da proteína em fusão com peptídeo de histidina e a expressão da enzima PEPCK. Uma vez obtida a enzima pura serão realizados os estudos dos parâmetros cinéticos da enzima para posterior utilização na busca de inibidores naturais ou sintéticos. A busca por inibidores da PEPCK será realizada em colaboração com os Profs. Drs. Arlene G. Correa e Paulo Cezar Vieira do Departamento de Química da UFSCar, que possuem bibliotecas de tais compostos.