Microscopias confocais para estudos de processos celulares no câncer

• Processo: 07/58018-1
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Pós-Doutorado
• Vigência (Início): 01 de março de 2008
• Vigência (Término): 28 de fevereiro de 2010
• Área do conhecimento: Ciências Exatas e da Terra - Física - Áreas Clássicas de Fenomenologia e suas Aplicações
• Pesquisador responsável: Carlos Lenz Cesar
• Beneficiário: Leverson Farias Lamonier Costa
• Instituição Sede: Instituto de Física Gleb Wataghin (IFGW). Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP). Campinas , SP, Brasil
• Assunto(s): Laser Microscopia confocal Óptica
• Palavra(s)-Chave do Pesquisador: Biofotonica | Celulas | Laser | Microscopia | Optica

Resumo

Os lasers firmaram-se, desde a sua descoberta na década de 60, como uma das mais importantes ferramentas industriais, médicas e principalmente de investigações científicas. Entre os vários lasers, podemos destacar os lasers de Ti.sapphire de pulsos,ultracurtos de femtosegundos (10-15 s) e de picosegundos (10-12 s) , onde a geração desses pulsos foi possível pela técnica Mode-Locked, demonstrada primeiramente nos meados de 1960 [1, 2]. O desenvolvimento destes lasers, possibilitou abrir um novo campo de pesquisa denominado Biofotônica de aplicações das técnicas ópticas (óptica não linear), ou fotônicas, em microscopia, na área das ciências da vida, como por exemplo, estudos de processos biológicos no interior de células vivas (Apoptose, Metástase, p53, células tronco, células cancerígenas). O desenvolvimento da ciência e dos métodos científicos contribuíram para redução de algumas doenças, que no passado era responsáveis por um índice grande de mortalidade como: doenças cardíacas, cerebrovasculares e infecciosas, as quais diminuíram pela metade chegando em 2002 a 30% do que eram em 1950. Entretanto, a mortalidade causada pelo câncer permanece praticamente estagnada. A grande dificuldade para o tratamento dessa doença advém do fato de que a mesma se deve a processos que se originam no nível celular. Na realidade, até hoje os processos celulares são pouco entendidos, mesmo os processos biológicos das células mais simples. Essa falha se deve, provavelmente, à falta de ferramentas que permitam a observação dos processos ao nível da célula, em conjunto com a complexidade dos mesmos, tanto ao nível bioquímico como biomecânico. O estudo de processos requer ferramentas capazes de observar remotamente, sem contacto e em tempo real uma seqüência de eventos ao longo do tempo, idealmente sem interferir no processo. Por outro lado, também é necessário ter a capacidade de disparar os processos que se pretende observar. Para estudos dos processos ao nível da célula, ou sub-celular, com dimensões típicas entre 1μm a 30μm, a utilização da fotônica é quase obrigatória. Primeiro devido à resolução espacial, que na óptica está no nível sub-celular (0.5μm a 0.2μm). Em segundo lugar porque os níveis de energia moleculares coincidem com as energias dos fótons tipicamente utilizados pela fotônica, do Ultra Violeta ao Infravermelho, o que confere seletividade bioquímica à fotônica. A natureza ondulatória da luz permite extrair informações morfológicas, bioquímicas e biomecânicas remotamente e não destrutivamente de camadas internas de células. Por outro lado, o comportamento de partícula dos fótons, abriu o acesso ao universo mecânico celular, com a técnica chamada pinça óptica. O fato de que as forças ópticas são da mesma ordem de grandeza das forças envolvidas em processos celulares e moleculares, abriu a oportunidade única para realização de manipulações e estudos mecânicos remotos ao nível celular. As desvantagens da fotônica frente a outras técnicas são a penetração pequena da luz e limiar de resolução em torno de 200 nm que não permite resolver espacialmente moléculas isoladas. Para estudo de processos ao nível de células vivas extraídas do tecido no microscópio a penetração não é um fator limitante. Por outro lado técnicas capazes de atravessar um corpo humano inteiro como Raios-X, Ressonância Magnética Nuclear ou Ultrasom não apresentam resolução espacial necessária para estudos ao nível celular/sub-celular. Já técnicas com altíssimas resolução espacial como microscopia eletrônica apresentam penetração muito menor e exigem ambiente de vácuo incompatível com os processos vitais. Microscopia de Força Atômica, com resolução ao nível atômico é uma técnica de contacto incapaz de observar não destrutivamente o interior das células, portanto. Trata-se, sem dúvida, de uma técnica extremamente útil para o observação de fenômenos de superfície de membranas, importantes para a imunologia. Entretanto, o limite de resolução em torno de 200 nm pode ser muito adequado para o estudo de uma enorme variedade de fenômenos vitais. Além disso, o limite da resolução óptica é dado pelas leis da óptica linear, não válidas para o regime da óptica não linear hoje incorporados à biofotônica. Resolução óptica de 15 nm já foi demonstrada com uma tecnibaHle1 fluorescência remota chamada STED [3]. Também existem outras técnicas que utilizam a transferência de energia entre moléculas para observar proximidades moleculares abaixo de 5 nm, como a técnica FRET. Desta forma, as técnicas de óptica linear e não linear modernas apresentam os meios mais adequados para o estudo de processos celulares, sem contacto, com interação não destrutiva das energias dos fótons em ressonância com os níveis moleculares eletrônicos (Fluorescência) e vibracionais. Hoje há um conjunto de técnicas em óptica linear e não-linear que permite o estudo dos processos celulares. O objetivo deste projeto é o desenvolvimento de ferramentas e procedimentos biofotônicos (microscopias confocais: CARS, SHG, Multifóton e Pinça Óptica) para estudos de processos cancerígenos ao nível das células, em particular para câncer de seio, com a colaboração da prof. Dr. Fátima Aparecida Bottcher Luiz da faculdade de Ciências Médicas da Unicamp. O trabalho será realizado pelo proponente Leverson Farias Lamonier Costa, dentro de um programa de pós-doutoramento no país da FAPESP, inserindo no âmbito das atividades do Centro de Pesquisa em Óptica e Fotônica (Proc. n° 1998/14270-8), um dos CEPIDS da FAPESP. O proponente defendeu em 16 de agosto de 2007 sua tese de doutoramento na Universidade Estadual de Campinas, sob orientação do Professor Dr. Daniel Pereira. Sua experiência profissional durante o doutorado nas áreas de Óptica e Física Molecular sem dúvida será essencial para o desenvolvimento das atividades previstas neste plano. O objetivo principal desse projeto é o estudo de processos biológicos (Apoptose, Metástase, gene p53, células tronco, células cancerígenas) dentro das células vivas, mediante as técnicas de microscopias confocais, entre elas: CARS, SHG, Multifóton e Pinça Óptica. O laboratório de Biofotônica do Departamento de Eletrônica Quântica do IFGW da UNICAMP foi pioneiro na técnica de Pinças Ópticas no Brasil na década de 1990. O histórico de colaborações e publicações multidisciplinares, principalmente com a Medicina e a Biologia da UNICAMP, do grupo do IFGW mostra que ele está completamente inserido em uma rede de colaborações multidisciplinar há muito tempo. Levantamento da rede de colaborações em Biofotônica realizado para o Sistema Paulista de Parques Tecnológicos mostrou que se trata de um dos grupos de Física mais "conectado" com a área de Ciências da Vida. Hoje ó laboratório está equipado com um sistema de microscopia confocal da Olympus, com sistema de varredura FV300 e microscópio automatizado 1X81. Um laser de Nd.YAG contínuo é utilizado para a pinça óptica. Um mini laser de Argônio operando em 488 nm [Omnichrome] e outro de He-Ne [633 nm] são utilizados para a Microscopia Confocal Convencional ["single photorf']. Um laser de estado sólido bombeado por laser de diodo [Millennia] com potência de 10 W é utilizado para bombear dois lasers de Ti.safira de pulsos ultracurtos em diferentes configurações. Em uma dessas configurações um laser de Ti.safira gera pulsos de 100 fs para efetuar a aquisição de imagens de fluorescência excitada por absorção de dois fótons e de microscopia SHG. Na outra configuração os lasers operam no regime de 5 ps, sintonizados em comprimento de onda independentemente, mas sincronizados no tempo com mecanismo de Lock- (AU)