Análise funcional da região promotora do gene GSN que codifica a enzima glicogênio sintase no fungo Neurospora crassa: identificação e caracterização do(s) fator(es) de transcrição que modulam a expressão gênica

• Processo: 10/01555-8
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Pós-Doutorado
• Data de Início da vigência: 01 de maio de 2010
• Data de Término da vigência: 31 de janeiro de 2014
• Área de conhecimento: Ciências Biológicas - Bioquímica - Biologia Molecular
• Pesquisador responsável: Maria Celia Bertolini
• Beneficiário: Fernanda Zanolli Freitas
• Instituição Sede: Instituto de Química (IQ). Universidade Estadual Paulista (UNESP). Campus de Araraquara. Araraquara , SP, Brasil
• Vinculado ao auxílio: 08/57566-8 - O fungo filamentoso Neurospora crassa como um organismo modelo para a identificação e caracterização de novas proteínas/fatores de transcrição regulando o metabolismo de glicogênio, AP.TEM
• Bolsa(s) vinculada(s): 12/22993-9 - Identificação de proteínas/complexos proteicos capazes de modular a expressão gênica em Neurospora crassa em situação de estresse térmico, BE.EP.PD
• Palavra(s)-Chave do Pesquisador: Choque térmico | Controle transcricional | glicogênio sintase | Neurospora crassa | Biologia Molecular de Microrganismos

Resumo

O projeto propõe um estudo da regulação, em nível transcricional, do gene que codifica a enzima glicogênio sintase (GSN) de Neurospora crassa. A glicogênio sintase é uma enzima altamente regulada por eventos de fosforilação e modulação alostérica, que catalisa a etapa de elongação da molécula de glicogênio, a etapa regulatória do metabolismo deste carboidrato. Estudos anteriores mostraram que a expressão do gene gsn é regulada negativamente sob diferentes condições estressantes, entre elas o choque térmico (30 para 45ºC). O isolamento da sequência nucleotídica da região 5' flanqueadora do gene GSN permitiu identificar a presença de vários elementos de DNA regulatórios, dentre eles duas cópias do elemento cis STRE (STress Responsive Elements), os quais estão presentes nos promotores de genes responsivos a várias condições estressantes. Ensaios de retardamento em gel (EMSA) realizados utilizando extratos nucleares preparados a partir de micélio de N. crassa submetido ao choque térmico demonstraram a funcionalidade destes elementos de DNA na condição de estresse estudada. Utilizando técnicas bioquímicas acopladas à espectrometria de massas foram identificadas ainda proteínas nucleares capazes de ligar ao elemento STRE do promotor GSN, as quais se encontram anotadas em banco de dados como proteínas hipotéticas ou proteínas preditas. Considerando que após a finalização do genoma do fungo, foram identificados aproximadamente 10.000 genes codificando proteínas e destes, apenas 13% estão representados por sequências codificando proteínas identificadas por similaridade a seqüências conhecidas e que o restante compreende as proteínas anotadas como proteínas hipotéticas conservadas e proteínas preditas (sem similaridade com qualquer outra proteína), N. crassa se torna um organismo modelo bastante promissor para identificar novas proteínas e atribuir funções a elas. Além disso, as análises de EMSA mostram a funcionalidade dos elementos regulatórios de DNA in vitro e talvez possam não refletir de modo fidedigno o que realmente acontece no núcleo da célula durante a situação de estresse estudada. Sendo assim, o presente projeto tem como principal objetivo a realização de ensaios funcionais que permitam demonstrar as interações STRE-proteínas nucleares durante a situação de choque térmico, in vivo, no fungo N. crassa. É importante enfatizar aqui que são poucos os laboratórios no país que se dedicam a estudar de maneira tão profunda a regulação da expressão gênica, sobretudo sob os aspectos transcricionais, e o modelo experimental proposto permitirá o uso de análises avançadas para melhor caracterizar a regulação do gene gsn em nível de transcrição. Os estudos propostos neste projeto encontram-se fundamentados em conhecimentos adquiridos durante a participação no curso Eukaryotic Gene Expression, realizado nos laboratórios de Cold Spring Harbor, CSHL, NY, USA. O curso abordou, de maneira bastante ampla, várias estratégias inovadoras para estudar a regulação da expressão gênica in vivo nas células eucarióticas, tais como o uso de RNA de interferência para silenciamento gênico, imunoprecipitação de cromatina e remodelagem de cromatina. O presente projeto pretende se beneficiar destas estratégias de análise, utilizando como modelo experimental a regulação do gene gsn durante estresse térmico. Além da oportunidade de desenvolver novas metodologias de análise de regulação da transcrição em células eucarióticas, o presente projeto irá contribuir para a formação de estudantes de pós-graduação e graduação do laboratório onde o projeto deverá ser executado e também estabelecer colaborações com pesquisadores de laboratórios de outras instituições nacionais e/ou internacionais. (AU)