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Isolamento e caracterização funcional de uma Fosfolipase A2 ácida do veneno de Bothrops atrox

Processo: 09/07801-3
Linha de fomento:Bolsas no Brasil - Iniciação Científica
Vigência (Início): 01 de julho de 2009
Vigência (Término): 30 de junho de 2010
Área do conhecimento:Ciências da Saúde - Farmácia - Análise Toxicológica
Pesquisador responsável:Suely Vilela
Beneficiário:Ithana Araujo
Instituição-sede: Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto (FCFRP). Universidade de São Paulo (USP). Ribeirão Preto , SP, Brasil
Vinculado ao auxílio:05/54855-0 - Toxinas animais: estrutura, função e aplicações biotecnológicas, AP.TEM
Assunto(s):Venenos de serpentes   Fosfolipases A2

Resumo

Introdução -Fosfolipases A2 (PLA2s; E.C.3.1.1.4) são enzimas, que catalisam especificamente a hidrólise de fosfolipídios na ligação éster do carbono 2, liberando lisofosfolipídios e ácidos graxos, em uma reação dependente de cálcio. Essas enzimas possuem uma grande variedade de efeitos farmacológicos e/ou tóxicos, como mionecrótico, anticoagulante, inibição de agregação plaquetária, neurotoxicidade, hipotensão arterial e indução de edema.Objetivo- O presente trabalho tem como objetivo o isolamento e caracterização funcional de uma fosfolipase A2 ácida do veneno de Bothrops atrox.Justificativa - Até o momento, as fosfolipases A2 isoladas e caracterizadas do veneno de Bothrops atrox foram uma miotoxina com atividade fosfolipásica e anticoagulante (Lomonte et al., 1990), a BaPLA2I e a BaPLA2III, básica e neutra respectivamente (Kanashiro et al., 2002) e a miotoxina I, uma PLA2 Lys49 (Núñez et al., 2004). É necessária a realização de mais trabalhos para que os componentes do veneno desta espécie de serpente sejam melhores estudados. Estes estudos podem resultar na obtenção de informações relevantes sobre as atividades biológicas dessa proteína, assim como poderia ser utilizada como modelos de futuros fármacos aplicados à clínica médica. Portanto, o presente trabalho visa contribuir para a elucidação e determinação da composição bioquímica dos venenos animais.Materiais e Métodos-Veneno - Veneno bruto liofilizado de Bothrops atrox será adquirido do SANMARU LTDA (Registro junto ao IBAMA n. 182238).CasuísticaPara avaliação dos efeitos sobre plaquetas serão coletadas amostras de sangue (15 mL) de 2 voluntários adultos de ambos os sexos, após a devida aprovação pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto (FCFRP-USP). O sangue será colhido por punção venosa na veia cubital do braço em tubos para coleta a vácuo após jejum de 8 horas, sendo que os riscos deste procedimento para os pacientes são jejum de 8 horas, sendo que os riscos deste procedimento para os pacientes são mínimos. Os materiais são descartáveis, não havendo riscos de contaminação.AnimaisPara experimentos de avaliação da atividade miotóxica e edematogênica serão utilizados 50 camundongos Swiss, machos pesando de 18 a 22g, fornecidos pelo Biotério da FCFRP-USP. Serão realizados injeções intra-musculares (ativ miotóxica) e sub-plantar(ativ. Edematogênica), sendo os animais, ao fim do experimento, eutanasiados em câmera de gás contendo CO2 na presença do pesquisador responsável.Aspectos éticos.O projeto de pesquisa foi submetido ao CEUA - Comissão de Ética no Uso de Animais - e também ao CONEP - Comite de Ética em Pesquisa dos Seres Humanos da FCF para utilização de plasma humano fornecido pelo Centro Regional de Hemoterapia de Ribeirão Preto, aguardando aprovação. Metodologia - O isolamento dessa enzima será realizado em três etapas cromatográficas (troca iônica, exclusão molecular e hidrofobicidade). A caracterização bioquímica dessa enzima será determinada por testes de determinação do peso molecular, ponto isoelétrico, quantificação de proteínas e sequenciamento N-terminal. A caracterização enzimática se dará por meio da atividade fosfolipásica dose-dependente e efeitos da temperatura e pH sobre essa atividade. A caracterização funcional será feita através das atividades anticoagulante, miotóxica e indução de edema. Efeito bactericida, atividade antitumoral e efeitos sobre plaquetas também serão verificados.

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