Construcao de uma biblioteca de cdna de cortex cerebral de rato para a expressao de dominios sh3 em leveduras

• Processo: 09/51065-0
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Iniciação Científica
• Data de Início da vigência: 01 de julho de 2009
• Data de Término da vigência: 30 de junho de 2010
• Área de conhecimento: Ciências Biológicas - Bioquímica - Biologia Molecular
• Pesquisador responsável: Luciana Amaral Haddad
• Beneficiário: Laís Gonçalves Garcia
• Instituição Sede: Instituto de Biociências (IB). Universidade de São Paulo (USP). São Paulo , SP, Brasil
• Assunto(s): Leveduras
• Palavra(s)-Chave do Pesquisador: Biblioteca De Expressao | Dominio Kh | Dominio Sh3 | Fmrp | Levedura | Proteina De Fusao

Resumo

A proteína do retardo mental do X Frágil (FMRP), codificada pelo gene do Retardo Mental do X Frágil (FMR1), liga-se a RNAs mensageiros (RNAm) por dois domínios KH, regulando sua tradução e a sinapse em neurônios pós-sinápticos. O FMR1 tem 17 éxons e seu transcrito pode sofrer splicing alternativo, pela exclusão dos éxons. 12 e 14 e/ou sítios alternativos em 5' dos éxons 15 e 17. A seqüência do éxon 12 do FMR1 é expressa em isoformas endógenas no cérebro. Sua inclusão no RNAm aumenta no córtex frontal na primeira semana pós-natal do rato. A região codificada por esse faz parte da alça variável do segundo domínio KH da FMRP, que tem função desconhecida, aparentemente não relacionada à ligação ao RNA. Análises in silico da seqüência codificada pelo éxon 12 do Fmr1 indicam dois motivos SH3 e proteínas com domínios SH3 em potencial para ligar-se a eles. Amplificamos, pela reação em cadeia da polimerase (PCR) com iniciadores degenerados, seqüências codificadoras para domínios SH3 a partir do DNA genômico de rato, Nossa hipótese é que o aumento do comprimento da alça variável do KH2 da FMRP pela expressão do éxon 12 possibilita sua interação com domínios SH3 de proteínas neuronais, ancorando-a em espinhas dendríticas. Pretendemos investigá-la pelo ensaio de blot overlay em filtro com levedura expressando domínios SH3. O objetivo deste projeto é a construção de uma biblioteca de cDNA de córtex frontal de rato para expressão de domínios SH3 em leveduras. Os produtos de PCR serão clonados em bactéria no vetor YCplac33GAL-ProtA, em fusão com a seqüência codificadora para proteína A. Clones serão seqüenciados e a biblioteca amplificada e estocada. (AU)