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Determinação dos Mecanismos de Indução de Lesões na Molécula de DNA pela Irradiação com luz UVA

Processo: 08/08683-1
Linha de fomento:Bolsas no Brasil - Iniciação Científica
Vigência (Início): 01 de setembro de 2008
Vigência (Término): 30 de junho de 2009
Área do conhecimento:Ciências Biológicas - Genética - Genética Molecular e de Microorganismos
Pesquisador responsável:Carlos Frederico Martins Menck
Beneficiário:Teiti Yagura
Instituição-sede: Instituto de Ciências Biomédicas (ICB). Universidade de São Paulo (USP). São Paulo , SP, Brasil
Vinculado ao auxílio:03/13255-5 - Genes de reparo de DNA: análise funcional e evolução, AP.TEM
Assunto(s):Reparo do DNA

Resumo

A radiação UVA é pouco absorvida pela molécula de DNA, mas é capaz de excitar outros cromóforos endógenos que geram lesões de DNA através da produção de espécies reativas de oxigênio (Cadet et al, 1997). Trabalhos recentes desafiam a hipótese de que a maioria dos danos de DNA induzidos pela radiação UVA sejam mediados por estresse oxidativo (Douki et al, 2003; Mouret et al, 2006). Estes mostram que há uma maior indução de lesões do tipo CPDs após irradiação de culturas de células com luz UVA do que lesões induzidas por espécies reativas de oxigênio. Através do desenvolvimento do sistema Dosímetro Biológico de DNA, foi possível detectar a indução de lesões oxidativas, CPDs e, surpreendentemente, 6-4PPs após a irradiação de amostras de DNA plasmidial em lâmpada de UVA no Laboratório de Reparo de DNA (Schuch et al, submetido). Desta forma, a proposta do presente trabalho consiste na irradiação de amostras de DNA plasmidial com luz UVA com diferentes abordagens experimentais e na presença de diferentes substâncias para estudar os possíveis mecanismos envolvidos na indução de lesões de DNA por estes comprimentos de onda, como por exemplo: a)Repurificação da amostra de DNA com fenol-clorofórmio para eliminar eventuais compostos cetônicos ligados à molécula de DNA;b)Preparação de DNA através de diferentes procedimentos de purificação (em gradiente de CsCl, seguido de diálise);c)Adição de catalase para eliminar a formação de H2O2 na solução;d)Adição de EDTA para eliminar metais eventualmente ligados à molécula de DNA como ferro e cobre;e)Adição de azida para eliminar a formação de oxigênio singlete na solução;f)Adição de nucleotídeos à amostra de DNA, para verificar uma possível absorção destes comprimentos de onda pelas bases nitrogenadas e conseqüente formação de estado excitado, resultando em espécies reativas dentro da própria molécula de DNA. A determinação e quantificação dos diferentes tipos de lesões de DNA formadas após as irradiações serão realizadas com a utilização de enzimas de reparo de DNA (glicosilase e endonucleases) que reconhecem e clivam o sítio contendo uma lesão específica. Complementando estas análises, são realizados ensaios de freqüência de mutação e da taxa de inativação biológica de DNA através do uso de linhagens de E. coli MBL50 (proficientes e deficientes em genes de reparo de DNA) e do vetor pCMUT, que transporta o gene supF como alvo mutagênico. Portanto, com a realização destas análises bioquímicas pretende-se desvendar se os fotoprodutos induzidos pela luz UVA na molécula de DNA são gerados por mecanismos indiretos, através de fotossensibilizadores ligados ao DNA, ou se são gerados de maneira direta, através da absorção destes comprimentos de onda pela molécula de DNA; e verificar a relevância biológica destas lesões através de análises biológicas de mutagênese e inativação de DNA pela transformação bacteriana com as amostras tratadas nas diferentes condições descritas.