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Expressão, purificação e ensaio de atividade dos domínios DUF442 e ETHE1 da proteína Blh de Xylella fastidiosa e Agrobacterium tumefaciens

Autor(es):
Nayara Patricia Vieira de Lira
Número total de Autores: 1
Tipo de documento: Dissertação de Mestrado
Instituição: Universidade Estadual de Campinas. Instituto de Biologia
Data de defesa:
Membros da banca:
Andréa Balan Fernandes; Artur Torres Cordeiro
Orientador: Celso Eduardo Benedetti
Resumo

Xylella fastidiosa e Agrobacterium tumefaciens são bactérias fitopatogênicas que infectam, respectivamente, o interior do xilema e de tecidos vasculares de raiz, ambientes cuja tensão de oxigênio é relativamente baixa. Uma vez que Xylella e Agrobacterium são bactérias estritamente aeróbicas, elas apresentam o operon bigR, responsável pela detoxificação do sulfeto de hidrogênio ou gás sulfídrico, um potente inibidor do citocromo c oxidase e respiração aeróbica. O operon bigR codifica cinco proteínas denominadas Blh (Beta-lactamase-like hydrolase), BigR (biofilm growth-associated repressor), um repressor transcricional e regulador do operon, e MP1-3, proteínas que compõem um transportador de membrana. Em trabalho anterior, foi demonstrado que mutantes de Agrobacterium deficientes na produção de Blh acumulavam gás sulfídrico, enquanto mutantes no repressor BigR secretavam mais sulfito, indicando que a proteína Blh convertia gás sulfídrico em sulfito e que este, que também é tóxico, seria exportado pelo complexo MP1-3. Além disso, dados de modelagem molecular indicaram que Blh poderia desempenhar funções de sulfotransferase e dioxigenase de enxofre, uma vez que apresenta os domínios DUF442 (rodanase) e ETHE1 (dioxigenase). A fim de testar tais hipóteses, este trabalho teve como principais objetivos a caracterização enzimática dos domínios DUF442 e ETHE1 da Blh de Xylella e Agrobacterium, como também confirmar interações proteína-proteína entre os componentes do operon bigR. Ensaios de atividade enzimática usando-se proteínas recombinantes purificadas confirmaram a função de dioxigenase de enxofre e de rodanase dos domínios ETHE1 e DUF442, respectivamente. Além disso, verificou-se que ambos os domínios produzem sulfito como produto final da reação, embora atuando em substratos diferentes. Ainda, ensaios de duplo híbrido de levedura mostraram haver inúmeras interações entre as proteínas do operon bigR, mas não entre os dois domínios DUF442 e ETHE1 de Blh que, de acordo com os ensaios enzimáticos, atuam de forma independente. (AU)

Processo FAPESP: 11/14969-8 - Purificação, cristalização e análise da atividade enzimática dos domínios ETHE1 e DUF442 da proteína BLH de Xylella Fastidiosa e Agrobacterium tumefaciens
Beneficiário:Nayara Patricia Vieira de Lira
Linha de fomento: Bolsas no Brasil - Mestrado