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Polifenoloxidase como fator de resistencia da soja a nematoides e na oxidação do palmito

Autor(es):
Milton Massao Shimizu
Número total de Autores: 1
Tipo de documento: Tese de Doutorado
Instituição: Universidade Estadual de Campinas. Instituto de Biologia
Data de defesa:
Membros da banca:
Carlos Augusto Colombo; Roberto Kazuhiro Kubo; Ladaslav Sodek; Marlene Aparecida Schiavinato; Jorge Vega; Claudia Regina Baptista Haddad
Orientador: Paulo Mazzafera
Resumo

A polifenoloxidase (PPO) há muito vem sendo estudada, seja na resistência em plantas a pestes e doenças, como também pela sua importância na indústria de alimentos. O primeiro capítulo apresenta o estudo da PPO da raiz de soja das variedades Cristalina (suscetível) e Hartwig (resistente) submetidas a dano mecânico, tratadas com metiljasmonato e infectadas com os nematóides Meloidogyne javanica e Heterodera glycines. Antes porém, uma rápida caracterização da PPO de soja mostrou que o triton X-100 aumentava a eficiência de extração, o dodecilsulfato de sódio (SDS) não aumentava a atividade e o ácido clorogênico era o melhor substrato da enzima. Nas plantas submetidas a dano mecânico e tratadas com metiljasmonato houve aumento da atividade da PPO, principalmente em Hartwig. Foi nesta variedade também a maior atividade detectada com a inoculação dos dois nematóides. As análises de fenóis totais não mostraram diferenças quantitativas ou qualitativas entre os tratamentos. Nos estudos moleculares foram isolados inicialmente cinco clones de PPO de raiz de soja, mas apenas dois destes fragmentos, JH1 e JH2, foram usados no preparo de sondas para estudos de Southern blot, que mostraram até 4 genes codificando para PPO. A análise de expressão por RT-PCR mostrou o aumento de transcrição somente com JH1, o que sugere que os genes para PPO não respondem da mesma forma ao mesmo estímulo. Cristalina tratada com metiljasmonato apresentou aumento de resistência a ambos os nematóides, enquanto em Hartwig não houve mudanças visíveis. No segundo capítulo foram feitas análises da PPO em folhas novas e velhas, raízes e palmito das palmeiras juçara, açaizeiro e pupunheira, onde maior atividade foi detectada em juçara, açaizeiro e pupunheira, respectivamente. De modo geral, folhas novas apresentaram maior atividade do que as velhas, e estas, atividade um pouco maior do que raízes. Na caracterização da PPO, o ácido clorogênico mostrou ser seu melhor substrato, com a melhor temperatura de reação entre 25oC (açaízeiro e pupunha) e 30oC (juçara). As melhores atividades foram observadas entre pH 5,5 e 6,0 do meio de reação. Houve inibição por inibidores específicos, tais como ácido salicilhidroxâmico, brometo de cetiltrimetilamônia e tropoleno. Os Ki´s foram determinados para as PPOs de juçara e açaizeiro com ácido salicilhidroxâmico (2,82 µM e 1,96 µM, respectivamente) e tropoleno (6,55 µM e 1,25 µM, respectivamente). SDS levou à perda de atividade da enzima. PPO de juçara e açaizeiro mostrou-se relativamente resistente a temperaturas altas. O Km para ácido clorogênico foi menor para pupunheira (0,59 mM), seguido de juçara (1,19 mM) e açaizeiro (1,91 mM). Análises de fenóis solúveis totais e, ácido clorogênico mostraram que pupunha tem considerável quantidade de fenóis, semelhante até ao teor encontrado em açaí e um pouco superior a juçara, mas ácido clorogênico foi aproximadamente dez vezes menor em pupunha que nas outras duas palmeiras. "Tissue printings" de cortes do caule das palmeiras mostraram que pupunha apresenta pouca reação de oxidação devido à baixa atividade da enzima e não à uma possível menor quantidade de fenóis ou mais especificamente, de ácido clorogênico. Nos estudos moleculares, os mesmos primers detectaram seqüências de PPO em palmito de açaizeiro e juçara. Apenas um foi comum com palmito da pupunheira. Foram isolados dois clones de PPO, PPOEd17 (juçara) e PPOAc45 (açaí). Não foi possível isolar nenhum clone de PPO de pupunha. Estes fragmentos apresentaram similaridade baixa entre eles, ao redor de 52%, e foram usados na fabricação das sondas usadas no Southern blot, que indicaram a presença de apenas um gene nas três palmeiras. A análise de expressão por RT-PCR detectou transcrição significativa apenas nos palmitos de juçara e açaí, mostrando que a baixa oxidação observada em palmito pupunha se deve à baixa expressão do gene codificando para essa enzima. Ainda assim, a falta de substrato específico, o CGA, não pode ser excluída como um fator que contribui para a menor oxidação, pois as análises mostraram a presença de outros fenóis em pupunha em quantidades parecidas ou até superiores, mas que podem não ser tão bons substratos para a PPO, provocando a sua menor oxidação. (AU)

Processo FAPESP: 00/01407-7 - Papel da enzima polifenoloxidase na resistência de soja a nematoides
Beneficiário:Milton Massao Shimizu
Linha de fomento: Bolsas no Brasil - Doutorado