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Caracterização de uma aldo-ceto redutase relacionada a patogenicidade de Xylella fastidiosa

Autor(es):
Luciana Kauer Rosselli
Número total de Autores: 1
Tipo de documento: Tese de Doutorado
Instituição: Universidade Estadual de Campinas. Instituto de Biologia
Data de defesa:
Membros da banca:
Jorg Kobarg; Marco Aurelio Takita; Alessandra Alves de Souza; Ana Carolina Zeri
Orientador: Anete Pereira de Souza
Resumo

o programa de seqüenciamento genômico da bactéria Xylella fastidiosa gerou um enorme número de ORFs ("Open Reading Frames" - quadro de leitura aberto ou genes putativos) pertencentes às categorias de patogenicidade, virulência e adaptação deste importante fitopatógeno. Uma destas ORFs (XF 1729) foi anotada como sendo uma fenilacetaldeído desidrogenase de 31,4 kDa. No entanto, a análise de sua seqüência primária de aminoácidos revelou similaridades com proteínas pertencentes à superfamília de aldo-ceto redutases. As proteínas desta superfamília são oxidorredutases NADPH-dependentes relacionadas funcionalmente e estruturalmente. Neste trabalho, a seqüência similar de X fastidiosa foi clonada no vetor de expressão pET32Xa/LIC com o objetivo de super expressar a proteína recombinante fusionada a seis resíduos de histidina em Escherichia colí BL21(DE3). A proteína expressa na fração solúvel foi purificada por cromatografia de afinidade em metal imobilizado (resina Agarose-IDA-Ni). O conteúdo de sua estrutura secundária foi verificado por espectroscopia de dicroísmo circular. As medidas de espalhamento de raios-X a baixo ângulo (SAXS) forneceram os parâmetros estruturais gerais (raio de giro de 27,5 :I: 0,8 Á e máxima dimensão de 90 Á) e indicaram que a proteína apresenta-se como um monômero em solução. Além disto, os cálculos estruturais ab initio mostraram que a proteína apresenta algumas similaridades com uma aldo-ceto redutase previamente cristalizada. A proteína XF 1729 purificada foi capaz de catalisar a redução dos substratos DL-gliceraldeído (Kcat 2.26 S-l, Km 8.20:1: 0.98 mM) e 2-nitrobenzaldeido (Kcat 11.74 S-l, Km 0.14:1: 0.04 mM) na presença de NADPH. A seqüência de aminoácidos da proteína XFI729 apresentou mais alta identidade (maior que 40%) com inúmeras proteínas de função desconhecida. Entre as AKRs identificadas, encontramos aproximadamente 29% dê identidade com YakC (AKRI3) de Schizosaccharomyces pombe, 30% e 28% com AKRIIA e AKRIIB, ambas de Baci/lus subtiZis, respectivamente. Os resultados estabeleceram a proteína XF 1729 como um novo membro da superfamília das AKRs, da nova sub-família AKR13B 1. Finalmente, os experimentos de caracterização por cromatografia de gel filtração indicaram que a proteína apresenta wna forma alongada, gerando wn peso molecular aparente maior que o esperado. Além da proteína AKRl3B 1, selecionamos mais duas proteínas codificadas pelas ORFs XFl934 e XFl532 para estudos de estrutura e função. A proteína HetI (XFI934), de 22,4 kDa, apresenta similaridade proteínas da família phosphopantetheinyl transferase, sendo necessária à síntese de ácido graxo via acetato na bactéria. A proteína XF1532, de 36,8 kDa, é sirpilar a reguladores transcricionais de extresse oxidativo, sendo sua seqüência similar (44%) à proteína OxyR de Escherichia coZi, a qual pertence à família LysR de reguladores transcricionais. As duas ORFs foram clonadas e expressas em Escherichia coZi, no entanto não foi possível obter a proteína na fração solúvel, impossibilitando o seguimento dos estudos de caracterização estrutural e funcional. A descrição da metodologia utilizada para produção destas proteínas e os resultados preliminares obtidos estão descritos no item Resultados Complementares desta tese. Um amplo benefício no conhecimento dos mecanismos de patogenicidade da X fastidiosa tem sido esperado, desde o seqüenciamento completo de seu genoma. Neste sentido, passos iniciais foram dados no sentido de se caracterizar a função das proteínas codificadas por seus genes (AU)

Processo FAPESP: 04/00474-3 - Expressão e purificação de proteínas relacionadas a patogenicidade de Xylella fastidiosa
Beneficiário:Luciana Kauer Rosselli
Linha de fomento: Bolsas no Brasil - Doutorado Direto