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Plantas como biorreatores : recuperação e purificação de aprotinina recombinante a partir de semente de milho transgenico

Autor(es):
Adriano Rodrigues Azzoni
Número total de Autores: 1
Tipo de documento: Tese de Doutorado
Instituição: Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP). Faculdade de Engenharia Quimica
Data de defesa:
Membros da banca:
Maria Candida Reginato Facciotti; David Toledo Velarde; Angela Maria Moraes
Orientador: Everson Alves Miranda
Resumo

A expressão em plantas transgênicas é potencialmente uma das formas mais econômicas de produção em larga escala de peptídeos e proteínas de emprego farmacêutico. Dentre as vantagens estão a capacidade de estocagem da biomolécula por longo período em sementes, o baixo custo de produção e escalonamento (basta aumentar a área plantada) e o pequeno risco de contaminação por agentes patogênicos aos humanos. Contudo, existem poucos trabalhos visando a avaliar o potencial das plantas transgênicas do ponto de vista da recuperação e purificação de biomoléculas (RPB) em larga escala. Neste trabalho foi estudada a recuperação e purificação de aprotinina recombinante, um inibidor de proteases utilizado como fármaco, produzida em sementes de milho transgênico. Mais do que desenvolver metodologias de purificação de uma proteína específica, este trabalho objetivou contribuir com novos conhecimentos sobre a utilização da planta de milho como biorreator. Condições de extração visando a maximização da eficiência de extração da aprotinina recombinante e minimização da extração de impurezas foram estudas. Destes estudos, a condição de extração a pH 3,0 e força iônica de 200 mM foi a que se mostrou mais adequada. A aprotinina recombinante, juntamente com um inibidor de tripsina naturalmente encontrado em sementes de milho (inibidor de tripsina do milho - ITM) foi capturada do extrato aquoso da semente através do uso de cromatografia em resina de agarose com tripsina imobilizada. Duas diferentes rotas cromatográficas foram empregadas para a separação entre os inibidores e purificação final da aprotinina: cromatografia em resina agarose-IDA-Cu2+ e cromatografia em resina SP Sepharose. A confirmação da purificação da aprotinina recombinante foi realizada através de seqüenciamento N-terminal, SDS-PAGE e HPLC, sendo que este último método de análise indicou que purezas tão elevadas quanto 97% foram alcançadas. Uma vez que o ITM também foi purificado, o processo aqui estudado tem como vantagem a possibilidade de sua co-produção. Finalmente, os resultados deste trabalho vem corroborar com pesquisas anteriores que indicam o potencial do uso de plantas como biorreatores (AU)

Processo FAPESP: 97/14662-0 - Produção em larga escala de proteínas recombinantes em plantas transgênicas: recuperação de aprotinina a partir de sementes de milho transgênico
Beneficiário:Adriano Rodrigues Azzoni
Linha de fomento: Bolsas no Brasil - Doutorado