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Cristalização de proteinas : monitoramento in situ de supersaturação atraves de espectroscopias ATR-FTER e Raman

Autor(es):
Rosana Emi Tamagawa
Número total de Autores: 1
Tipo de documento: Tese de Doutorado
Instituição: Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP). Faculdade de Engenharia Quimica
Data de defesa:
Membros da banca:
Marco Giulietti; Roberto Guardani; Cesar Costapinto Santana; Adriano Rodrigues Azzoni
Orientador: Everson Alves Miranda
Resumo

Neste trabalho as espectroscopias ATR-FTIR ("Attenuated Total Reflectance - Fourier Transform Infrared Radiation") e Raman foram utilizadas no monitoramento e controle de supersaturação de proteínas. Nos estudos utilizando A TR-FTIR foi desenvolvida uma célula para cristalização por difusão de vapor adaptada a um elemento de reflectância interna ATR de germânio (Ge), possibilitando assim o monitoramento in situ nesse sistema. O monitoramento da concentração de soluções de lisozima no interior dessa célula se baseou em um modelo de calibração PLS ("Partial Least Squares") construído a partir de espectros de soluções com concentrações conhecidas dessa proteína. Esse aparato foi aplicado com sucesso na concentração lenta e gradual de soluções de lisozima e o monitoramento da concentração protéica ao longo do tempo se mostrou bastante preciso. Na presença de cristais, entretanto, houve influência dos mesmos sobre o monitoramento da solução, causado pela decantação e suposta interação dos cristais com a superfície do elemento de Ge. Embora não tenha ocorrido adsorção protéica a partir da solução no elemento A TR, a disposição das moléculas no hábito cristalino parece favorecer a adsorção dos cristais de proteína no Ge. Além desse sistema, foi avaliada uma sonda A TR de sele neto de zinco (ZnSe) que apresentou a vantagem de não sofrer influência significativa da temperatura na predição de concentrações de lisozima, gerando a possibilidade de ser aplicada no controle da supersaturação por temperatura. Essa sonda, entretanto, apresentou deficiência no monitoramento ao longo do tempo, de soluções de lisozima e tripsina, devido à provável adsorção protéica no elemento ATR. A espectroscopia AT -FTIR foi assim inadequada para o monitoramento de supersaturação nas condições estudadas. A espectroscopia Raman, apesar de não ser tradicionalmente utilizada para quantificações, permitiu o monitoramento in sftu da supersaturação com relativa precisão. Um modelo de calibração PLS desenvolvido a partir de soluções padrão de aprotinina e (NH4):zSO4 possibilitou medidas simultâneas de suas concentrações durante cristalizações em gota suspensa ("hanging-drop"). Através dessa possibilidade determinou-se a solubilidade de aprotinina na presença de NaCI e (NH4hSO4 a partir de gotas de 10 _l de solução e demonstrou-se o controle da supersaturação propiciando aumento do tamanho dos cristais de aprotinina em cerca de três vezes em relação à cristalização sem controle de supersaturação. O monitoramento simultâneo da concentração de proteína e sal, trouxe evidências da co-cristalização de aprotinina e (NH4)2S04, isto é, de que ambas as moléculas participaram na formação dos cristais. Dessa forma, apesar do potencial da espectroscopia infravermelho, verificou-se a superioridade da metodologia de monitoramento baseado na espectroscopia Raman. Uma das principais vantagens desse segundo método foi a aplicação da sonda de fibra óptica que permitiu medidas remotas e de modo não invasivo, tendo em vista que a interação de proteínas com diferentes materiais pode ser um problema crítico no monitoramento in situ de suas soluções (AU)

Processo FAPESP: 98/15965-0 - Cristalização de proteínas: monitoramento in situ de supersaturação de soluções de aprotinina por espectroscopia
Beneficiário:Rosana Emi Tamagawa
Linha de fomento: Bolsas no Brasil - Doutorado