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Características bioquímicas e estruturais do domínio catalítico da celulase CelE2 e sua relação com o domínio acessório Calx-beta : Biochemical and structural features of the catalytic domain of cellulase CelE2 and its relation with the Calx-beta accessory domain

Texto completo
Autor(es):
Agnes Cristina Pimentel
Número total de Autores: 1
Tipo de documento: Dissertação de Mestrado
Data de defesa:
Resumo

As glicosil hidrolases (GHs) compõem uma classe de enzimas amplamente utilizadas nos processos enzimáticos por atuarem na hidrólise das ligações glicosídicas de polissacarídeos. Além do domínio catalítico, diversas GHs apresentam domínios acessórios que podem influenciar diversos aspectos bioquímicos e estruturais das enzimas. A celulase CelE2 de origem metagenômica, caracterizada recentemente, apresenta em sua estrutura um domínio catalítico N-terminal característico da família GH5 e um domínio C-terminal com identidade para o domínio Calx-beta, previamente identificado em outras GHs mas sem função claramente definida nestes casos. Com o intuito de investigar as características bioquímicas e estruturais dos domínios de CelE2 separadamente, foram construídas derivações truncadas referentes ao domínio catalítico e ao domínio acessório Calx-beta. Como resultados, observou-se que a excisão do domínio acessório Calx-beta (CelE2382-477) não provocou alterações nas características bioquímicas de CelE2, visto que o domínio catalítico (CelE21-381) apresentou valores semelhantes de atividade enzimática em beta-glucano, carboximetilcelulose e liquenana, valores de pH e temperatura ótimos próximos de 5,3 e 45 ºC, respectivamente, estabilidade térmica a 40 ºC e 50 ºC por 360 minutos e aumento de atividade enzimática na presença de CaCl2. O perfil de degradação e as evidências de transglicosilação também foram mantidas após a excisão do domínio acessório Calx-beta. No entanto, o domínio catalítico apresentou um aumento de cerca de 4 vezes da atividade enzimática na hidrólise de Avicel, comparado à CelE2. As análises por dicroísmo circular (CD) de CelE21-381 indicaram um perfil predominante de alfa-hélice, diminuição de 4,6 ºC da temperatura de desnaturação e um aumento destes valores na presença de CaCl2, tanto para a construção completa, quanto para CelE21-381. Assim como para CelE2, as análises por espalhamento de raio-X de baixo ângulo (SAXS) mostraram que a adição de CaCl2 resultou na diminuição da tendência de agregação proteica para CelE21-381. Os ensaios de avaliação da ligação a polissacarídeos solúveis e insolúveis indicaram que CelE2382-477 não apresentou capacidade de ligação para os substratos testados. A estrutura tridimensional do domínio catalítico CelE21-381 foi determinada a uma resolução de 2,1 Å que permitiu a identificar um enovelamento do tipo barril (alfa/beta)8. Os resultados obtidos mostraram que a presença do domínio acessório Calx-beta não é fundamental para atividade enzimática de CelE2, de modo que a alteração mais significativa diz respeito ao aumento da atividade enzimática do domínio catalítico em Avicel em comparação à construção completa. Estes resultados contribuirão para estudos futuros acerca deste domínio pouco estudado entre as celulases e informações para a família 5 das GHs (AU)

Processo FAPESP: 16/01926-2 - Influência de um domínio acessório nas características bioquímicas e estruturais da celulase CelE2
Beneficiário:Agnes Cristina Pimentel
Linha de fomento: Bolsas no Brasil - Mestrado