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Chlorogenic acid and its relationship with lignin biosynthesis : Ácido clorogênico e sua relação com a biossíntese de lignina

Texto completo
Autor(es):
Nathalia Volpi e Silva
Número total de Autores: 1
Tipo de documento: Tese de Doutorado
Instituição: Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP). Instituto de Biologia
Data de defesa:
Membros da banca:
Douglas Silva Domingues; Paula Macedo Nobile; Michael dos Santos Brito; Sara Adrián López de Andrade
Orientador: Paulo Mazzafera; Igor Cesarino
Resumo

Fenilpropanóides são compostos derivados da fenilalanina e estão envolvidos em vários aspectos relacionados à defesa de plantas. Alguns desses fenilpropanóides são os ácidos clorogênicos (CGA). A biossíntese de CGA é mediada pela enzima hidroxicinamoil quinato transferase (HQT). Embora nunca provado, alguns trabalhos sugerem que o pool de CGA poderia estar relacionado com a biossíntese de lignina. Outra enzima, a hidroxiciamoil chiquimato esterase (HCT), parece estar envolvida nas rotas de biossíntese de lignina e ácido clorogênico. Assim como a HCT, a HQT utiliza p-coumaoil CoA para formação de ésteres de hidrocinamoil chiquimato ou hidroxicinamoil quinato, respectivamente. Além disso, a enzima cafeoil chiquimato esterase (CSE) foi descrita como envolvida na conversão de cafeoil chiquimato em ácido cafeico, o qual é convertido em cafeoil CoA. Dessa forma, CSE compartilha o substrato com a enzima HCT, sugerindo que uma mudança em sua expressão deva interferir não apenas no metabolismo de lignina, mas também no metabolismo de CGA. Por terem intermediários em comum, é possível que haja interdependência entre essas vias, e CGA possa atuar como doadora de esqueleto de carbono para a biossíntese de lignina. Desta forma, este trabalho objetiva trazer mais informações a fim de entender a relação entre estas duas vias de biossíntese. No capítulo 1 trouxemos uma revisão com foco na relação entre os principais genes envolvidos na interdependência entre CGA e lignina, os genes HCT, HQT e CSE, com objetivo de conectar os dados disponíveis na literatura que tratam deste assunto. No capítulo 2 focamos na relação entre estas vias e os genes HCT e CSE, trazendo dados importante que reforça a importância do braço da rota que utiliza chiquimato tanto para lignina como para CGA. No capítulo 3 construímos e validamos vetores para edição de genoma os genes HCT, CSE e CCoAOMT com objetivo de futuramente desenvolvermos plantas mutantes para estes genes via CRISPR/Cas9. A construção de mutantes e duplos mutantes super-expressando e silenciando os genes HCT, HQT e CSE pode contribuir para esclarecer a natureza dessa interdependência entre o pool de CGA e lignina, assim como validar o papel da enzima CSE como um componente da via de lignina em Nicotiana tabacum. Análises de bioinformática identificaram quatro isoformas putativas do gene HCT e duas do gene CSE em N. tabacum, a espécie escolhida para estudo. Com objetivo de obtermos mutantes para estes genes foram desenhadas várias construções para transformação estável: pCaMV35S::CSE (CSE super-expressão), pCaMV35S::HCT (HCT super-expressão); pCaMV35S::HQT (HQT super-expressão); pCaMV35S::amiRNACSE (CSE silenciamento), pCaMV35S::HCT::pCsVMV::amiRNAHQT (HCT super-expressão combinada com HQT silenciamento); pCaMV35S::HQT::pCsVMV::amiRNAHCT (HQT super-expressão combinada com HCT silenciamento), e pCaMV35S::HCT::pCsVMV::amiRNACSE (HCT super-expressão combinada com CSE silenciamento). As plantas silenciadas para o gene CSE (amiCSE) apresentaram comprometimento severo do desenvolvimento e não produziram descendentes indicando a importância da CSE para o desenvolvimento normal em N. tabacum. Em contrapartida, as linhagens de HCTamiCSE e CSE não apresentaram alteração do fenótipo. Essas plantas foram cultivadas até T1 e então submetidos às seguintes análises: fenotípica, expressão gênica, lignina, polissacarídeos de parede celular, sacarificação e perfil fenólico. As plantas analisadas não apresentaram alteração da composição de lignina, mas apresentaram alteração no metabolismo de CGA, especialmente as plantas super-expressando o gene CSE, indicando um provável papel de CGA como esqueleto de carbono para o metabolismo de lignina. Além disso, nós também construímos e validamos vetores utilizando a ferramenta de edição de genoma via CRISPR/Cas9 para os genes HCT, CSE e CCoAOMT em folhas de N. tabacum. Apesar de vários estudos sugerirem uma interconexão entre as vias de lignina e CGA, a maior parte das análises foram feitas in vitro. O fato dos nossos mutantes terem a composição de CGA afetada sugere fortemente que essas vias são interconectadas, e que CSE tem um papel decisivo na via de biossíntese em N. tabacum (AU)