Efeito de mutações no gene aire induzidas por CRISPR-Cas9 na atividade transcricional, pós-transcricional de células mTEC e na sua função sobre a migração de timócitos

Resumo

O (a) bolsista estudará o efeito de mutações no gene Aire, associadas com a síndrome APS1, sobre dois dos processos essenciais das células mTEC durante a indução de tolerância imunológica central no timo, ou seja, a migração timócitos - mTECs que é essencial para que ocorra a adesão entre essas células. Além disso, avaliaremos se essas mutações influem no transcriptoma, incluindo os mRNAs e miRNAs e a interação entre essas moléculas. Como já discutido no projeto geral, a interação entre timócitos e as células tímicas epiteliais (TECs) é essencial para o desenvolvimento desses dois tipos celulares. Para testar essa hipótese, utilizaremos o sistema modelo de migração dos timócitos (ensaio transwell). Faremos a seleção das mutações do gene Aire humano (domínios SAND e PHD) montar o sistema CRISPR-Cas9, prosseguindo com as transfecções de células mTEC e seleção e caracterização dos clones Aire mutantes. As células mTEC controle (wt) e mTEC Aire mutantes servirão para o ensaio transwell (migração celular). O clone mutante mTEC3.10E6 (mutação no exon 3, domínio NLS de Aire) já foi isolado em nosso laboratório. Dessas células, faremos extrações de RNA total, cujas amostras serão hibridizadas com microarrays para avaliarmos as eventuais alterações no transcriptoma (mRNAs), no miRnoma (miRNAs) e as interações pós-transcricionais envolvendo miRNAs-mRNAs. Os resultados serão úteis para estabelecermos uma associação entre as mutações de Aire com a atividade gênica dessas células e sua função biológica sobre timócitos (migração timócitos - mTECs). (AU)