Entendendo a arquitetura de promotores relacionados a formação de biofilme sob diferentes condições de crescimento em larga escala

Resumo

Biofilmes são estruturas bacterianas influenciadas por mudanças ambientais, como variação de pH, diferenças de temperatura, disponibilidade de fonte de carbono e fase de crescimento bacteriano. Essas influências são processadas em diferentes camadas, desde a regulação transcricional até modificações pós-traducionais. Na regulação transcricional, diferentes fatores de transcrição podem se ligar e/ou se desligar de uma grande variedade de sítios de ligação ao promotor de acordo com os sinais intra e extra-celulares que recebe, compreendendo uma complexa rede regulatória para o desenvolvimento do biofilme. Assim, as regiões do sítio de ligação do promotor podem variar de acordo com os sinais ambientais, fases de crescimento bacteriano e seu modo de vida (livre ou séssil). Atualmente, o SortSeq é uma das abordagens mais modernas para estudar a regulação gênica de forma funcional. Essa metodologia possibilita a inferência da dinâmica da arquitetura promotora através da construção de uma biblioteca de promotores (contendo diferentes promotores e suas variantes mutadas aleatórias) modulando a expressão de uma proteína fluorescente. Além disso, essa técnica também permite uma análise de vários promotores (e suas variantes mutadas) sob diferentes condições ambientais em poucos experimentos. Contudo, ela tem sido aplicada somente com bactérias em modo de vida livre, desconsiderando possíveis alterações na regulação gênica que possam ocorrer durante o modo de vida séssil. Portanto, o objetivo deste projeto é padronizar e aplicar o ensaio de SortSeq em bibliotecas de promotores associados à formação de biofilme a partir do cultivo dessa biblioteca transformada em Escherichia coli BW25113 em formação de biofilme estático e submerso cultivados sob diferentes condições ambientais. Esses resultados serão então comparados aos resultados do SortSeq da mesma biblioteca nas mesmas condições do estilo de vida livre, padronizado na Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto (FMRP). Nosso objetivo é analisar 21 promotores diferentes com 349 variantes mutadas cada, totalizando 7350 promotores. O projeto será realizado no Laboratório de Redes Microbianas dirigido pelo Prof. Dr. Victor Sourjik no Instituto Max Planck de Microbiologia Terrestre (Marburg, Alemanha), visto que seu laboratório desenvolveu o referido procedimento e apresenta ampla experiência em estudos da rede regulatória de biofilme. (AU)