Papel do TSC22D3, um fator de transcrição de zíper de leucina induzido por glicocorticóide, no relógio molecular circadiano

Resumo

Ritmos diários na fisiologia e no comportamento de mamíferos são regulados por um sistema circadiano, que é composto de um oscilador central no núcleo supraquiasmático (NSQ) e osciladores periféricos em quase todos os tecidos do organismo. Dentro dos osciladores central e periféricos, um ritmo autossustentado é gerado a partir de um mecanismo intracelular composto de alças interligadas de retroalimentação moleculares, baseadas na transcrição e tradução coordenadas de genes do relógio. O sistema circadiano interage com o eixo hipotálamo-hipófise-adrenal em diferentes pontos de regulação, resultando em um ritmo diário na liberação de glicocorticoides (GC) para a corrente sanguínea. Nos tecidos-alvo, o GC ativa a transcrição de genes alvo, dentre os quais está Tsc22d3, um fator de transcrição de zíper de leucina induzido por glicocorticoides. Este gene é ritmicamente expresso em diferentes tecidos de ratos, camundongos e humanos. Evidências bioquímicas indicam que o gene Tsc22dD3 pode funcionar como uma aferência, uma eferência ou um componente do mecanismo circadiano intracelular. Neste projeto BEPE, investigaremos o papel desempenhado pelo gene dentro dos osciladores circadianos, por meio de interferências genéticas sobre Tsc22dD3, seguidas da avaliação de efeitos na expressão dos genes do relógio. Em nosso primeiro objetivo, a função de Tsc22d3 será estudada em linhagens celulares de camundongos in vitro, por knockdown transcricional utilizando RNAi, em fibroblastos, adipócitos e hepatócitos. Posteriormente, uma inibição mais profunda será realizada com knockout completo, usando o sistema CRISPR/Cas9 para deletar grandes porções do gene. Interferências genéticas podem ter diferentes efeitos em células e tecidos complexos, como o NSQ. Portanto, como um segundo objetivo, observaremos a expressão dos genes do relógio em explantes de NSQ submetidos a knockdown ou superexpressão de Tsc22d3. Como terceiro objetivo, observaremos se outras vias bioquímicas são afetadas pela inibição, uma vez que o fator de transcrição pode funcionar como uma eferência. Para tanto, verificaremos o perfil das alterações transcricionais em larga escala no genoma de linhagens celulares, com RNA-seq, após a inibição de Tsc22d3. Finalmente, como último objetivo, iniciaremos o processo de geração de uma linhagem de camundongo knockout para Tsc22d3, utilizando o sistema CRISPR/Cas9, para futura avaliação de ritmos comportamentais e nos tecidos, sob inibição completa do gene. Este projeto sobre os mecanismos moleculares dos osciladores circadianos será um complemento conceitual e metodológico para o projeto atual de pós-doutorado com modelos genéricos de osciladores.