Perfil proteômico da saliva em pacientes com Doença de Parkinson após a prática de exercício físico de alta intensidade

Resumo

O objetivo do projeto será avaliar o perfil proteico salivar de adultos com doença de Parkinson e adultos controle, antes e após a realização de atividade física de alta intensidade, para identificação de possíveis biomarcadores de acompanhamento da evolução da doença. Participarão 20 adultos com doença de Parkinson e 20 adultos, pareados pela idade e gênero, sem a doença de Parkinson. Estes participantes serão recrutados do Laboratório de Pesquisa em Movimento Humano (MOVI-LAB) da UNESP/Bauru. Será coletada saliva total não estimulada de cada participante, adicionando-a a tubos Falcon de 50 mL imersos em gelo por 10 a 15 minutos, a fim de obter pelo menos 10 mL de saliva por participante. A saliva será coletada antes e imediatamente após a prática de estímulo aeróbico, supervisionada e com duração de 30 minutos em uma esteira ergométrica (Inbramed ATL, Inbrasport, Porto Alegre, Brazil) no MOVILAB. A saliva coletada será centrifugada e o sobrenadante armazenado em tubo criogênico a -80ºC. Para a extração proteica, 100 µL de cada amostra serão aliquotados em tubos separados e diluídos 1:1 com solução de extração ureia 6 M, toureia 2 M e NH4HCO3 50 mM (pH 7,8). Na sequência, serão agitados por 10 minutos a 4ºC e colocados em banho ultrassônico por 5 minutos e centrifugados, repetindo esta sequência de procedimentos mais duas vezes. Após extração, serão formados 3 pools de amostras por participante, as quais serão concentradas a 150 µL em tubos Falcon Amicon. As cadeias de aminoácidos serão clivadas com tripsina a 2% (p/p) (Promega®, EUA) por 14 h a 37 ºC. As amostras serão purificadas e dessalinizadas e 1 µL de cada amostra será utilizado para quantificação proteica pelo método de Bradford (Bio-Rad®, EUA). As amostras serão ressuspensas e submetidas à análise por espectrômetro de massa acoplado à cromatografia (LC-ESI-MS/MS, Waters, Wilmslow, Reino Unido). Posteriormente, será realizada a análise de peptídeos típicos no sistema ACQUITY UPLC (Waters, EUA) acoplado ao espectrômetro de massa Xevo Q-TOF G2 (Waters, EUA). A identificação das proteínas será realizada de acordo com o software ProteinLynx Global Server (PLGS) versão 3.03 (Waters, EUA) e os resultados baseados no banco de dados do Homo Sapiens do catálagoUniProt (Universal Protein Resource). A diferença de expressão entre os grupos será calculada usando o algoritmo MonteCarlo e expresso em p<0,05 para proteínas presentes em menor abundância e 1-p>0,95 para proteínas presentes em maior abundância. Ao final, as proteínas salivares apresentadas em cada grupo serão comparadas e classificadas de acordo com a expressão aos termos do mapeador genérico da Universidade de Princeton (Generic Gene Ontologv - GO - TermFinder). A ferramenta de pesquisa IBI-IMIM será usada para identificar proteínas candidatas a biomarcadores (banco de dados de biomarcadores relacionados a doenças).