Bases moleculares da toxicidade de oligômeros proteicos associados a amiloidoses do sistema nervoso

• Processo: 15/16411-5
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Programa Capacitação - Treinamento Técnico
• Data de Início da vigência: 01 de setembro de 2015
• Data de Término da vigência: 30 de abril de 2016
• Área de conhecimento: Ciências Biológicas - Bioquímica - Química de Macromoléculas
• Pesquisador responsável: Adriano Silva Sebollela
• Beneficiário: Artur Fernandes
• Instituição Sede: Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto (FMRP). Universidade de São Paulo (USP). Ribeirão Preto , SP, Brasil
• Vinculado ao auxílio: 14/25681-3 - Bases moleculares da toxicidade de oligômeros protéicos associados a amiloidoses do sistema nervoso, AP.JP
• Assunto(s): Neurobiologia Doença de Alzheimer Oligômeros Anticorpos Neurônios Toxicidade
• Palavra(s)-Chave do Pesquisador: Alzheimer | Anticorpos | beta-amilóide | neurônios | neurobiologia

Resumo

O bolsista será responsável, após período de treinamento diretamente comigo, pelo preparo dos oligômeros de Abeta, seguindo o protocolo de Lambert e cols. (1998). Em resumo, o peptídeo Abeta (obtido comercialmente) é ressuspendido, incubado por 24h a 4ºC, centrifugado (para remoção de Abeta na forma fibrilar) e o sobrenadante coletado. As preparações são feitas semanalmente, pois os oligômeros são metaestáveis, e devem ser sempre dosadas (determinação de proteína total) e caracterizadas por eletroforese/Western Blot e cromatografia de gel-filtração. O bolsista deverá também cuidar da expressão e purificação dos scFv's anti-A²Os em bactérias previamente transformadas com vetor contendo gene para scFv anti-A²Os (seguindo os protocolos descritos em Nissim et al., 1994). No formato livre de fago, a cultura é incubada a 37°C sob agitação até atingir a DO600 de 0,9, quando a expressão é induzida com IPTG. No dia seguinte, a cultura é centrifugada e o sobrenadante usado na purificação em coluna de afinidade (proteína A ou Ni, scFv expresso em fusão com cauda de histidina). Para produção de scFv's anti- A²Os ligados a fago, parte-se de uma cultura saturada de E. coli TG1 previamente transformada com vetor contendo gene para scFv anti-A²Os. Após co-infecção com helper phage KM13 e seleção com canamicina, a cultura e' centrifugada e o sobrenadante contendo fagos expressando scFv na superfície é purificado por precipitação com PEG/NaCl. Dependendo do desempenho/interesse do bolsista, vislumbra-se treinar/atribuir também ao bolsista as tarefas de manutenção de linhagem de neuroblastoma humano SH-SY5Y (incluindo repiques, trocas de meio e congelamento/descongelamento) e apoio na manutenção/experimentos com animais (testes comportamentais).