Suplementação de aminoácidos em meios, estabelecimento de condições físicas adequadas durante a produção in vitro e padronização de eletroporação em zigotos suínos.

• Processo: 22/15373-6
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Programa Capacitação - Treinamento Técnico
• Data de Início da vigência: 01 de dezembro de 2022
• Data de Término da vigência: 30 de novembro de 2024
• Área de conhecimento: Ciências Biológicas - Genética - Genética Animal
• Pesquisador responsável: Silvano Mario Attilio Raia
• Beneficiário: Ligiane de Oliveira Leme
• Instituição Sede: Faculdade de Medicina (FM). Universidade de São Paulo (USP). São Paulo , SP, Brasil
• Vinculado ao auxílio: 21/11872-5 - Centro de Ciência para o Desenvolvimento em Xenotransplante, AP.CCD
• Assunto(s): Engenharia genética
• Palavra(s)-Chave do Pesquisador: Clonagem Suínos | engenharia genética | xenotransplante | Embriologia Edição Genética

Resumo

Durante os estágios de pré-implantação, oócitos e embriões in vivo são transportados ativamente para o útero por contrações do oviduto e do músculo uterino, bem como pelo batimento ciliar. Dentro desse ambiente físico, elas são submetidas a estímulos mecânicos como tensão de cisalhamento induzida pelo fluido tubário, compressão causada pelo movimento peristáltico da parede tubária e forças de atrito cinético originadas entre o embrião e os cílios. Pesquisas sugeriram queessas forças mecânicas induzem a comunicação extracelular e exercem efeitos benéficos aorefrescar o fluido ao redor do embrião e eliminar metabólitos. Para melhorar a cultura de embriões in vitro imitando este ambiente físico, pretendemos avaliar as condições físicas mais adequadas (vibração, pressão superficial, e concentração de O2) durante a maturação de oócitos e cultivo de embriões in vitro. Espécies reativas de oxigênio (ROS) como ânions superóxido (O2 ), peróxido de hidrogênio (H2O2) e radicais hidroxila (OH) causam danos à membrana celular e fragmentação do DNA. Embriões em estágio inicial de clivagem são sensíveis ao estresse oxidativo resultando em inibição do desenvolvimento embrionário. As ROS foram diretamente implicadas no bloqueio de embriões de 2 células. Neste contexto, para proteger a linhagem germinativa contra o estresse oxidativo, existem vários mecanismos de defesas que podem ser utilizados na maturação e cultivo de embriões in vitro. O sistema da glutationa (GSH) é um dos principais mecanismos de proteção contra o estresse oxidativo. O aumento nos níveis de GSH em oócitos maturados in vitro está associado a melhora do desenvolvimento embrionário suíno após fertilização in vitro. Vários estudos indicam quea adição de compostos do ciclo ³- glutamil ao meio de maturação in vitro tem um efeito positivodurante o cultivo in vitro de oócitos suínos. Na tentativa de aumentar as concentrações de glutationa(GSH) intracelular no oócito, pretendemos adicionar o aminoácido (l-glutamato) aos meios de MIV e CIV, pois o l-glutamato é o precursor da porção glutamina de GSH e é convertido via ³-glutamilcitocinasintetase. Além disso, planejamos também adicionar aos meios MIV e CIV o aminoácido arginina, pois este é usado para produzir óxido nítrico (NO) pelo óxido nítrico sintase (NOS). Existem três isoformas da NOS: neuronal (NOS1), induzível (NOS2) e endotelial (NOS3). A expressão detodas as três isoformas foi detectada nos períodos de pré-implantação de embriões (zigoto, blastocisto). Contudo, foi visto que a L-arginina estava esgotada nos meios de cultura de embrião invitro de suíno, sugerindo que ocorre a metabolização deste aminoácido durante o desenvolvimento embrionário. Sequencialmente, na tentativa de reaproveitar os oócitos provenientes da maturação in vitro planeja-se padronizar um protocolo para edição gênica de zigotos suínos partenogenéticos pelo método de eletroporação.