Viabilidade da detecção de DNA e sequenciamento genético de Toxoplasma gondii em amostras de leite bovino e queijo frescal

• Processo: 25/13487-2
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Iniciação Científica
• Data de Início da vigência: 01 de outubro de 2025
• Data de Término da vigência: 30 de setembro de 2026
• Área de conhecimento: Ciências Agrárias - Medicina Veterinária - Medicina Veterinária Preventiva
• Pesquisador responsável: Gustavo Felippelli
• Beneficiário: Gabrielle Jacobs de Lima
• Instituição Sede: Faculdade de Medicina Veterinária (FMVA). Universidade Estadual Paulista (UNESP). Campus de Araçatuba. Araçatuba , SP, Brasil
• Assunto(s): Reação em cadeia por polimerase (PCR) Técnica indireta de fluorescência para anticorpo Saúde Única Parasitologia veterinária
• Palavra(s)-Chave do Pesquisador: Derivados lácteos | Pcr | Rifi | Saúde Única | Parasitologia Veterinária

Resumo

O diagnóstico de Toxoplasma gondii através do leite bovino in natura é controversa e de pouco estudo, por ser uma enfermidade de caráter zoonótico e de grande relevância junto ao contexto saúde única, objetivou-se no presente estudo investigar a soroprevalência e a detecção molecular de Toxoplasma gondii em vacas em lactação, em propriedades com baixo controle sanitário da região Noroeste Paulista, que produzam como principal derivado lácteo o queijo fresco (cru). Serão selecionadas propriedades de nível pequeno a médios produtores, cuja atividade de produção é a bovinocultura leiteira, totalizando uma amplitude média de 10 a 200 animais por propriedade. Será realizado questionário comtemplando o perfil sanitário das propriedades. Serão realizados exames imunoparasitológicos (imunofluorescência indireta) para a presença de animais com titulações IgM e IgG. Serão coletadas alíquotas de leite de cada quarto mamário (50 a 200 amostras) por animal e acondicionados em tubos Falcon livre de DNAse. Serão adquiridos queijos frescos (100 amostras) confeccionados de forma artesanal com o leite desses animais provenientes dessas propriedades. A extração de DNA seguirá a metodologia realizando por (Pokorska et al., 2016): Para a detecção de Toxoplasma gondii, realiza-se PCR, que possui como alvo o fragmento não codificante de 529 pb (Primers: TOX4 e TOX5). Os amplicons das amostras positivas, serão extraídos e purificados do gel de agarose com o uso do GenElute¿ Gel Extraction Kit (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA), conforme o protocolo do fabricante. Após, os amplicons serão encaminhados ao sequenciamento de Sanger bidirecional, utilizando-se os primers da reação secundária como iniciadores. Após o sequenciamento, as sequências consensos serão determinadas utilizando o software Codoncode Aligner versão 4.0.1 (CodonCode Corporation Dedham®, MA, USA), e alinhadas com sequências homólogas disponíveis no GenBank por meio do Blast (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). Uma árvore filogenética será inferida pelo método Maxima verossimilhança e baseada no modelo de distância genética Tamura 3 parâmetros. A ramificação será realizada com o suporte bootstrap, baseado em 1000 replicações e os filogramas serão desenhados usando o Mega sequence align versão 11. As sequencias obtidas neste estudo, serão depositadas no Genbank. Os dados resultantes do protocolo de PCR serão analisados por meio de teste qui-quadrado com o auxílio do software Jamovi 2.3.28 e Epi Info 7.2.6.0 a fim de determinar a prevalência das variáveis, serão consideradas estatisticamente significativas quando p ¿ 0,05.