Clonagem de genes da via de 2-metilcitrato sintase do catabolismo de propionato em Burkholderia sp e obtenção de mutantes por recombinação homóloga, mais eficientes para a produção de p3HB-co-3HV: um plástico biodegradável

• Processo: 00/00690-7
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Mestrado
• Data de Início da vigência: 01 de maio de 2000
• Data de Término da vigência: 30 de abril de 2002
• Área de conhecimento: Ciências Biológicas - Microbiologia - Microbiologia Aplicada
• Pesquisador responsável: Luiziana Ferreira da Silva
• Beneficiário: Érica Mendes Pereira
• Instituição Sede: Instituto de Pesquisas Tecnológicas S/A (IPT). Secretaria de Desenvolvimento Econômico (São Paulo - Estado). São Paulo , SP, Brasil
• Assunto(s): Polímeros biodegradáveis Plásticos biodegradáveis Propionatos
• Palavra(s)-Chave do Pesquisador: Clonagem | Microbiologia Aplicada | Polimeros Bacterianos | P3Hb-Co-3Hv

Resumo

Poli-3-hidroxibutirato (P3HB) e poli-3-hidroxibutirato-co-3-hidroxivalerato (p3HB-co-3HV) têm despertado interesse industrial, pois podem substituir plásticos de origem petroquímica em diversas aplicações, com a vantagem de serem biodegradáveis e produzidos a partir de matérias-primas renováveis. O IPT tem estudado a produção destes polímeros desde 1992, e um dos resultados deste trabalho foi o isolamento da linhagem bacteriana Burkholderia sp IPT 101, produtora do copolímero P3HB-co-3HV a partir de carboidratos e propionato, selecionada por: ser capaz de consumir sacarose, apresentar velocidade específica máxima de crescimento (µmax) igual a 0,39 h-1, maior que linhagens empregadas industrialmente, e acumular até 80% do peso seco como polímero. A partir de 1996, com o apoio da FAPESP (proc. n° 96/02289-0), visando melhorar o fator de conversão de propionato em unidades 3HV apresentado pela linhagem selvagem (Y3HV/Prop= 0,10 g/g), foram obtidos mutantes incapazes de consumir este substrato para o crescimento (prp-), porém ainda capazes de utilizá-lo para a incorporação de unidades 3HV ao copolímero, destacando-se o mutante IPT 189 que passou a apresentar Y3HV/Prop = 0,80 g/g. O estudo molecular deste mutante levou ao sequenciamento do gene, que ao ser bloqueado, conferiu o fenótipo (prp-), e cujo produto apresenta alto grau de similaridade com citrato sintases de diferentes organismos. Avaliando-se características dos diferentes mutantes obtidos, bem como o papel chave da enzima citrato síntase no ciclo dos ácidos tricarboxílicos e as vias metabólicas conhecidas para o catabolismo de propionato, foi proposta a existência de pelo menos duas vias para o consumo deste substrato em Burkholderia sp IPT 101, sendo que, sob condições de acúmulo de P3HB-co-3HV, a via da 2-metilcitrato sintase seria a mais importante para o consumo de ácido propoiônico, sobretudo frente a baixa oferta deste substrato. Entretanto o fragmento de DNA sequenciado não apresentou o gene completo, havendo assim necessidade de idenificar suas regiões adjacentes. Isto permitirá além de comprovar a existência da via de 2-metilcitrato sintase ainda não descoberta para esta bactéria, a obtenção de mutantes (prp-), por recombinação homóloga. Nesta proposta, pretende-se: (a) Clonar fragmentos de DNA contendo genes envolvidos na via de 2-metilcitrato sintase do catabolismo de propionato em Burkholderia sp IPT; (b) estabelecer o mapa físico dos fragmentos clonados; (c) construir estruturas que permitam a obtenção de mutantes por recombinação homóloga; (d) avaliar quantitativamente a eficiência dos mutantes obtidos e a capacidade de conversão de propionato a unidades 3HV, comparando com a linhagem selvagem (IPT 101) e seus mutantes (prp-) obtidos por irradiações U.V (IPT 189). (AU)