Transferencia nuclear em suinos: uso de fibroblastos fetais como fonte doadora de nucleos.

• Processo: 02/10747-1
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Mestrado
• Data de Início da vigência: 01 de março de 2003
• Data de Término da vigência: 28 de fevereiro de 2005
• Área de conhecimento: Ciências Agrárias - Medicina Veterinária - Reprodução Animal
• Pesquisador responsável: José Antonio Visintin
• Beneficiário: Mariana Groke Marques
• Instituição Sede: Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia (FMVZ). Universidade de São Paulo (USP). São Paulo , SP, Brasil
• Assunto(s): Clonagem Embrião Maturação Fibroblastos Suínos
• Palavra(s)-Chave do Pesquisador: Citoplasma Receptor | Clonagem | Embrioes | Fibroblasto | Maturacao | Suinos

Resumo

O objetivo deste estudo será avaliar a viabilidade de embriões suínos reconstruídos a partir de oócitos enucleados em Metáfase II e núcleos de células somáticas (fibroblastos fetais. Oócitos serão maturados in vitro por 44 horas e enucleados mediante a remoção do primeiro corpúsculo polar (CP) e da placa metafásica, com auxílio de micropipeta e micromanipulador. A eficiência da enucleação será confirmada pela exposição do conteúdo aspirado à luz ultravioleta. Para a reconstrução, uma única célula doadora será inserida sob a membrana pelúcida de cada oócito receptor. O complexo citoplasma receptor-núcleo doador será submetido a um pulso elétrico de 95 volts durante 45s para a fusão das membranas da célula doadora e do oócito receptor. A ativação será feita por incubação em 15M de ionomicina de cálcio por 20 minutos seguida de incubação em 1,9mM de 6-dimetiloaminopurina (DMAP) em meio TCM199 por 3 à 4 horas. Após avaliação das taxas de fusão, os embriões reconstruídos e ativados serão cultivados em meio NCSU 23 suplementado com 4mg/ml de BSA por 5 dias, seguido de 4 dias de cultivo em NCSU23 suplementado com 20% de Soro Fetal Bovino. Após a determinação das taxas de clivagem, de mórulas, de blastocistos e de eclosão nos dias 3, 7, 8 e 9 de cultivo, respectivamente, sendo os embriões eclodidos corados e fixados para determinação do número de células. (AU)