Estudo e desenvolvimento de proteinas de fusao para o transporte intracelular de vetores nao virais atraves de proteinas motoras.

Resumo

A baixa eficiência de transferência gênica é um problema recorrente na utilização de vetores não virais em estudos de terapia gênica e vacinação por DNA. Essa limitação provém principalmente da dificuldade de transporte do DNA estrangeiro do exterior para o núcleo das células-alvo, devido à presença de inúmeras barreiras físicas, enzimáticas e difusionais. O principal objetivo do projeto aqui proposto é o desenvolvimento de proteínas recombinantes de fusão capazes de interagir e facilitar o transporte intracelular de vetores plasmídicos (pDNA), explorando-se a capacidade natural de proteínas motoras (como a dineína) para o transporte de cargas da periferia para o interior (centrossoma) de células de mamífero. Proteínas de fusão contendo domínios N-terminais de ligação às dineínas e domínios ou sequências C-terminais de ligação ao DNA (5 a 16 resíduos de aminoácidos básicos) serão primeiramente clonadas e produzidas em E. coli. As interações proteínas de fusão-pDNA serão então avaliadas em ensaios in vitro e por transfecções de células de mamífero em cultura, por meio da quantificação da expressão do gene repórter GFP por microscopia de fluorescência e citometria de fluxo. O tráfego intracelular dos complexos será estudado por hibridização in situ de fluorescência (Fish), avaliando-se a capacidade das proteínas de fusão de facilitar o tráfego intracelular do pDNA por meio de interações com dineínas, além da translocação do pDNA para o núcleo favorecido pela porção C-terminal da proteína. Uma consequência esperada deste projeto é o desenvolvimento de carreadores proteicos capazes de reduzir o gap que diferencia atualmente os vetores não virais dos virais, além de proporcionar melhor compreensão do papel de proteínas motoras como a dineína no tráfego intracelular de transgenes. (AU)