Expressão diferencial e padrão de metilação da região MHM durante o desenvolvimento gonadal de galinhas

Resumo

As Aves apresentam o sistema de cromossomos sexuais ZZ/ZW (macho e fêmea, respectivamente). Os mecanismos de determinação sexual para esses animais pareçe envolver genes Z- e W-específicos. Há evidências de que mecanismos epigenéticos possam estar associados, incluindo nesse caso a região hipermetilada no macho (MHM), a qual é transcrita em um RNA não codificante que se acumula próximo ao sítio de transcrição, de forma similar ao que ocorre com o RNA Xist. No entanto, não há dados suficientes que demonstrem a existência de um mecanismo de compensação de dose em Aves. O objetivo do presente projeto é o de implantação de um modelo de estudo de determinação e diferenciação sexual além de compensação de dose em Aves, para utilização em experimentos de avaliação epigenética gonadal e de células germinativas. Neste estudo, serão avaliados o padrão de metilação e a expressão diferencial da região MHM durante o desenvolvimento gonadal de galinhas. Embriões de Gallus gallus serão removidos dos ovos, estagiados de acordo com os critérios de Hamburger e Hamilton, e a região gonadal será retirada nos estadios pré-diferenciação gonadal (20HH e 25HH), durante (28HH e 35HH) e pós-diferenciação (40HH). Testículos e ovários adultos também serão avaliados. Amostras de DNA serão sexadas pelo teste com o gene CHD. O padrão de metilação da região MHM será avaliado utilizando-se o ensaio COBRA (Combined Bisulfite-Restriction Analysis) e por enzima sensível à metilação associada à PCR em tempo real. A análise de expressão será realizada por transcrição revsera seguida de PCR em tempo real para seqüências dos genes DMRT1, AMH, DAX1, SOX3, SOX9, HINTZ e HINTW e da região MHM. Com os resultados obtidos será possível identificar um perfil de expressão nos estágios pesquisados e a correlação entre a expressão dos genes/região analisados e o padrão da metilação da região MHM, dados essenciais para verificação do real papel da região MHM no desenvolvimento gonadal e em um possível mecanismo de compensação de dose de comportamento extremamente particular em suas características, em relação aos outros animais. (AU)