Estudo de novas metodologias para realização de ensaios com a catepsina D na busca de inibidores

Resumo

A catepsina D é uma aspartil endopeptidase envolvida em muitos processos patológicos quando expressa de forma desregulada. Além disso, é responsável pela degradação da hemoglobina ingerida por parasitos causadores da Esquistossomose. Por esses motivos a catepsina D é considerada um alvo importante na busca de inibidores. Os ensaios comumente realizados para avaliação da inibição dessa enzima monitoram produtos reacionais gerados a partir da clivagem de substratos peptídicos fluorogênicos ou a hemoglobina humana na presença de inibidores, que podem apresentar autofluorescência/absorbância nos mesmos comprimentos de onda utilizados. Considerando esta problemática, este trabalho apresenta o desenvolvimento e aplicação de quatro metodologias para a realização de ensaios com a catepsina D. Em duas metodologias os ensaios são realizados em solução, sendo que, em uma delas utiliza-se a catepsina D bovina isolada, e na outra se emprega um extrato de proteínas retirado de vermes adultos de Schistosoma mansoni. Um terceiro ensaio foi desenvolvido para estudo de inibidores por meio do biorreator CatD-IMER acoplado a um sistema multidimensional no qual é possível monitorar a atividade da enzima imobilizada diretamente por meio da quantificação do produto formado. Por fim, a última metodologia foi desenvolvida imobilizando-se o substrato hemoglobina humana em cristal de quartzo. Sua hidrólise pela catepsina D foi avaliada por meio do uso da técnica de microbalança de cristal de quartzo, uma metodologia que monitora a atividade enzimática através de variações de massa. Nos ensaios enzimáticos foram avaliados 20 extratos de plantas, que levaram ao isolamento e identificação do alcaloide evolitrina, do composto 4-hidroxi-3-metoxicinamaldeído e dos flavonoides orientina e isovitexina. 31 compostos puros também foram ensaiados e, dentre estes, a substância (z)-2-(pentadec-5-enil)benzeno-1,4-diol apresentou atividade expressiva tanto frente à enzima isolada quanto em relação ao extrato de proteínas de S. mansoni. Para finalizar, a catepsina D recombinante de S. mansoni foi clonada e expressa em sistema E. coli, e ensaios in vitro com compostos isolados de produtos naturais mostraram excelentes resultados em relação ao limonoide cedrelona frente à esquistossômulos e vermes adultos de S. mansoni. (AU)