Análise proteômica e de expressão gênica comparativa do cemento dental e do osso alveolar humanos.

Resumo

O cemento dental e o osso alveolar são tecidos mineralizados com diversas similaridades quanto a sua origem, estrutura e composição. Entretanto, acredita-se que cementoblastos e osteoblastos são células fenopiticamente distintas, e que existam marcadores específicos que possam ajudar a caracterização dessas células como linhagens únicas. Com base nessa hipótese, este estudo tem como objetivos: 1) gerar uma lista de dados proteômicos do cemento dental e osso alveolar humanos, e fazer uma análise comparativa da composição da matriz orgânica para diferenciar os dois tecidos; 2) analisar comparativamente as proteínas envolvidas no processo de regulação e sinalização celular do cemento dental e osso alveolar humanos; 3) analisar o perfil de expressão de células do cemento dental e células do tecido ósseo de alvéolos de molares de camundongos. Após a coleta de amostras de cemento dental humano de dentes extraídos e de osso alveolar, as proteínas da matriz extracelular serão extraídas, digeridas em tripsina e liofilizadas para análise proteômica e fosfoproteômica por meio de cromatografia líquida-espectrometria de massa (LC-MS/MS). Visando a confirmação dos resultados, as técnicas de Western blot e imunohistoquímica serão utilizadas para detectar as proteínas consideradas únicas do cemento dental e do osso alveolar. Para o estudo do perifl de expressão gênica dos cementoblastos, cementócitos, osteoblastos e osteócitos, as mandíbulas de camundongos adultos Swiss Webster serão fixadas em methacarn e processadas para inclusão em parafina. Cortes de 7 µm da região dos primeiros molares serão microdissecados e 500-1000 células serão capturadas, seguindo da extração e amplificação do RNA, e síntese de cDNA. A técnica de "microarray" será utilizada para a análise de expressão gênica de aproximadamente 44.000 genes utilizando plataforma Roche NimbleGen para Eucarioto, camundongo (Roche NimbleGen, USA), e as diferenças significantes encontradas entre as células serão confirmadas por qPCR.