Identificação de genes envolvidos à anidrobiose através da interferência por RNA (RNAi)/ensaio de viabilidade após dessecação

Resumo

A água é considerada a matriz da vida, o meio onde ocorrem todas as reações bioquímicas. Sua ausência nas células acarreta a desnaturação das proteínas e colapso das biomembranas - morte. Neste sentido algumas espécies desenvolveram estratégias para superar situações de estresse hídrico. Um exemplo clássico constitui-se de pequenos animais que vivem em poças temporárias de água. A evaporação das mesmas leva à dessecação destes espécimes, que entram em um estado de animação suspensa conhecido como anidrobiose (do grego, "vida sem água"), restaurando suas atividades após reidratação. O conhecimento completo das vias moleculares envolvidas neste processo é um requisito para a engenharia anidrobiótica (EA): um campo recente que destina-se a tornar células/estruturas biológicas tolerantes ao estresse hídrico. A viabilidade preservada na ausência de água traria um imenso avanço na medicina, transplante de órgãos, manutenção de banco de células e tecidos, transporte de vacinas e muitas outras aplicações. A necessidade de validar estes genes no processo de resistência à dessecação e identificação de novos elementos exige ferramentas de genética reversa. Recentemente o primeiro painel de cDNAs do verme anidrobiótico Panagrolaimus superbus foi construído. Este projeto visa identificar, através de uma avaliação em larga escala via RNAi, o envolvimento de 100 cDNAs dentro deste painel. Mais especificamente, este projeto visa a clonagem de cDNAs correspondentes em vetorde expressão de dsRNA (L4440), produção de bactérias expressando os dsRNAs correspondentes,RNAi em larga escala em P. superbus via alimentação, confirmação do silenciamento por RT-PCRe teste de viabilidade em anidrobiose (confirmação da participação na via).P. superbus será cultivado de acordo com a literatura. Os cDNAs (fornecidos pelo grupo do Dr. Alan Tunnacliffe) serão subclonados no vetor L4440 e posteriormente inseridos na linhagem bacteriana HT115 (DE3). A RNAi por alimentação será desenvolvida como descrito na literatura e a confirmação molecular do silenciamento dar-se-á por RT-PCR. Após o silenciamento gênico, a população de P. superbus será submetida ao teste de viabilidade em condições de dessecação (exposição à baixa umidade relativa, RH 10%, e posterior reidratação). O silenciamento de genes associados a anidrobiose levará a uma redução da viabilidade normal (que é de 95%) após este procedimento. A anidrobiose é um fenômeno biológico intrigante, cujas bases fisiológicas e moleculares são pouco conhecidas. A compreensão deste processo é de grande interesse pois, entre outros, levaria à engenharia anidrobiótica (EA): o desenvolvimento de estratégias para tornar estruturas e sistemas biológicos resistentes ao ressecamento. Tal abordagem tem especial aplicação em países tropicais como o Brasil, nos quais a perda de água (por evaporação, transpiração e outros) é um fenômeno acentuado. Essa desidratação contínua e elevada tem implicações consideráveis no transporte de materiais biológicos (vacinas, enzimas, anticorpos e outros), células e tecidos em cultura, e órgãos para transplante. Este projeto visa confirmar a participação de genes associados à anidrobiose, possivelmente identificando novos elementos/vias. A identificação completa de vias permitirá reconstruirmos tais processos em células não-anidrobióticas, gerando um grande avanço na área biomédica. A nucleação dentro da Universidade Estadual de Campinas de um grupo voltado para pesquisas na área de anidrobiose ocupa simultaneamente nichos científicos importantes nesta instituição. Primeiramente porque há poucos grupos brasileiros que trabalham com anidrobiose (nenhum na UNICAMP), apesar de ser uma área de pesquisa muito promissora na aplicação biotecnológica. Adicionalmente, duas novas espécies-modelo (P. superbus e o verme C. elegans) serão introduzidas na instituição. (AU)