Avaliação de biofilmes multiespécie formados em diferentes substratos e expostos a concentrações salivares de agentes antimicrobianos: quantificação de microrganismos e morfologia tridimensional do biofilme

Resumo

A formação e acúmulo de biofilme em substratos presentes na cavidade oral é o principal fator etiológico das doenças bucais. Estudos avaliando biofilme multiespécie são escassos e muito pouco se conhece da organização tridimensional das espécies presentes no biofilme e das alterações que poderiam ocorrer no mesmo na presença de antimicrobianos excretados na saliva. O objetivo deste estudo será avaliar biofilme multiespécie formado em substratos presentes na cavidade oral quando expostos a concentrações salivares de diferentes agentes antimicrobianos. Serão utilizados espécimes de três substratos: hidroxiapatita, titânio e resina acrílica. Após a mensuração da rugosidade de superfície e esterilização por óxido de etileno, os espécimes serão acondicionados em placa de 24 poços para a formação da película adquirida. Em seguida será acrescentado meio fluido universal (FUM) contendo inóculo dos 6 microrganismos a serem estudados: Actinomyces naeslundii, Veillonella dispar, Fusobacterium nucleatum, Streptococcus sobrinus, Streptococcus oralis e Candida albicans. As placas serão incubadas em anaerobiose a 37º C até completar a formação de um biofilme de 72 h. Em seguida os espécimes serão imersos em meio FUM contendo um dos agentes antimicrobianos (azitromicina, metronidazol ou fluconazol) por 24 h. Para mensuração das células viáveis, o biofilme será removido dos substratos através de sonicação (7 watts, 30 segundos) em solução tampão fosfato (PBS). Essa solução será diluída serialmente em PBS e plaqueada nos meios de cultura ágar sangue Columbia, ágar Mitis Salivarius, ágar Fastidious Anaerobe e ágar Biggy. Após incubação, as contagens das unidades formadoras de colônia (UFC) serão realizadas com o auxílio de um microscópio estereoscópico e expressas em UFC/mm2. A visualização das espécies em cores distintas dentro do biofilme será realizada através da Hibridização in situ por Fluorescência (FISH) e observação em microscopia confocal a laser. As contagens de UFC e a microscopia confocal serão realizadas no biofilme formado (baseline) e após a imersão em agente antimicrobiano. (AU)